[发明专利]携带FL基因重组质粒的纳米阳离子脂质体、制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种可高效携带FL基因重组质粒的新型纳米阳离子脂质体、制备方法及应用。

背景技术

结肠癌是极为常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率逐年上升，严重威胁着人类的健康。手术治疗作为传统的治疗手段之一，虽可以切除肿瘤病灶，但无法彻底清除体内所有的癌细胞，而残存的癌细胞则可以引起肿瘤的复发与转移。放疗、化疗作为手术治疗有力的辅助治疗手段，对清除残留癌细胞、防止肿瘤的复发与转移大有裨益，但因其本身存在的严重的毒副作用及癌细胞对其可能存在的不敏感性或抗药性，使其临床应用受到了很大的限制。

近年来，随着分子生物学的迅猛发展，肿瘤的基因治疗给人类克服肿瘤的威胁带来了希望，众多学者对结肠癌的基因治疗进行了大量研究，但至今，在基因治疗方面尚受诸多因素影响，效果并不理想。目前，以逆转录病毒和腺病毒等作为基因载体尽管转染效率很高，但制备复杂、具有免疫原性，存在严重安全隐患且不能在体内反复应用等弊端，并不能成为一种满意的基因载体。而非病毒载体采用人工合成的非生物活性材料携带、运输核酸物质进入细胞内，目前最常用的非病毒基因载体是阳离子脂质体等。阳离子脂质体虽具有低毒、低免疫反应、可修饰性强等优点，但转染效率仍较低，靶向分布不理想，稳定性较差。因此，如何制备安全、无毒副作用的基因载体，如何高效、靶向将目的基因运送到机体的靶部位发挥效应，从而起到分子水平治疗的效果，仍是基因治疗中一个亟待解决的难题。

FL是一种膜蛋白，可调节造血干P祖细胞的增殖与分化，并可与多种细胞因子协同，提高造血功能。FL可促进树突状细胞(DC)、自然杀伤细胞(NK)、细胞毒T淋巴细胞(CTL)的增殖、分化与成熟，发挥其生物学效应，从而表现出抗肿瘤免疫作用，可显著抑制肿瘤的生长和转移。

纳米粒（Nanoparticles，NP）是近年发展起来的一类非病毒类载体。纳米粒是粒径10-500nm之间的固状胶态粒子，它可增强基因耐核酸酶的能力，同时起到控释作用，延长其在体内的有效作用时间，纳米粒子还具有无毒，无免疫原性和可生物降解等优点，因其良好的组织穿透能力，极易被细胞吸收，因此作为基因治疗的载体有着独特的优越性。

纳米阳离子脂质体粒为一种人工合成的载体材料，可运载质粒DNA、蛋白质、缩氨酸及低分子量的化合物，可在体内生物降解，其人体内的安全性、细胞毒性等研究已得到了普遍的认可。阳离子脂质体纳米粒包裹或吸附的治疗基因一般在24h内经历首次突发释放，其后进入缓慢释放的阶段长达一月之久，并保持所负载质粒的结构和功能的完整性，使质粒持久的释放和表达。阳离子脂质体纳米粒有较大的比表面积，可在其表面连接靶向分子或促进细胞转运的因子，从而实现基因治疗的主动靶向性，因其独特的优越性而备受重视。因此，纳米阳离子脂质体同时具有缓释作用和基因介导的双重功能，是一种有着良好发展前景的一类非病毒类载体。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一是提供一种能够携带FL基因重组体的纳米阳离子脂质体，可以在肿瘤细胞中释放出FL基因重组体并表达FL，从而发挥抗肿瘤的效应，具有高效低毒等优点；目的之二在于提供所述可携带FL基因重组体的纳米阳离子脂质体的制备方法，操作简便易行；目的之三在于提供所述能够携带FL基因重组体的纳米阳离子脂质体在抑制肿瘤生长方面的应用。

携带FL基因重组体的纳米阳离子脂质体，其特征是，依据静电吸附原理，由Lipofectamine2000和携带FL基因的重组质粒pEGFP-cl-FL构成；所述携带FL基因的重组质粒pEGFP-cl-FL为将FL基因克隆至含有绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP-c1载体中制得。

所述二者的最优比为8:1(8μl/1μg)，其中Lipofectamine 2000以体积计，携带FL基因的重组质粒pEGFP-cl-FL以质量计。

为达到上述目的，本发明的可高效在体内外转染基因的新型纳米级阳离子脂质体是通过以下方法制备的，该方法包括以下步骤：

（1）基因的合成：化学合成FL基因序列（SEQ-1），全长510bp，共编码169个氨基酸残基，将合成的基因进行序列测定。

（2）重组质粒puc57-FL的制备：将FL基因克隆至puc57载体的Sal Ⅰ和BamH Ⅰ之间，并将克隆有FL基因的重组质粒puc57-FL进行酶切验证及序列测定。