[发明专利]一种长片段末端文库的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学测序技术领域，具体涉及一种长片段末端文库（Long Mate Pair，LMP）的构建方法，以及该方法在基因组序列拼接，特别是 de novo 测序与组装中的有效应用。

背景技术

目前，二代测序方法已广泛的应用于基因组de novo拼接中，由于测序数据巨大且测序长度短，影响拼接质量的关键因素是基因组的重复序列（如微卫星序列，核糖体RNA序列，转座子序列等），重复单元的长度在几bp到几kb不等。构建多种不同长度插入片段的文库进行测序，可以跨越不同长度的重复序列，有效地改善基因组的拼接完整性和准确性。LMP基于基因组中较大跨度（2~10kb）片段两端序列的测序，解决大基因组和复杂基因组的组装问题，纠正重复序列造成的拼接错误，并能够发现基因组的结构变异，特别适用于新基因组测序（De novo sequencing）。目前，几种(long mate pair文库构建的方法存在效率较低，实验过程复杂，不易控制，错误率较高，嵌合分子以及低文库复杂性等缺点。因此，简单有效的LMP方法对于新一代测序技术的发展与应用具有重要作用，但是目前仍然处于改善与探索的过程中。

发明内容

本发明的目的是提供一种长片段末端文库构建的方法，可以有效的减少文库构建的步骤，缩短文库构建的时间，提高文库构建的效率，从而弥补现有技术的不足。

本发明的方法，其步骤如下：

1）首先将基因组DNA随机打断，并将打断的DNA进行末端缺口补齐修复；

2）将修复的DNA片段的3′端加上脱氧腺苷酸A，制成A-Fragment；

3）将制成A-Fragment与3′端带有突出的脱氧胸甘酸T的 LMP Adaptor进行粘性末端的连接，获得环状的LMP-Adaptor-Fragment；

4）将去除了未环化的线性分子的LMP-Adaptor-Fragment用不少于两种的识别四个碱基的限制性内切酶消化adaptor以外的区域，获得相应的酶消化文库；

5）将步骤4）获得的酶消化文库中的片段进行末端缺口补齐修复后，按照步骤3）再次进行环化；

6）将步骤5）获得的环化产物用核酸外切酶消化去除未环化的线性分子；用纯化后的环状分子作为模版，LMP Adaptor的引物进行扩增，扩增产物回收后完成LMP文库的构建。

上述步骤1）将打断的DNA进行末端缺口补齐修复是用T4 DNA polymerase来进行的；

步骤4）中所述的识别四个碱基的限制性内切酶为Hha I、Nla III、Hpa II、Mse I或MluC I。

步骤6）中所述的LMP Adaptor的引物的序列为SEQ ID NO:1和2。

本发明的建库方法，只需要合成两条63 bp的寡核苷酸序列，进行简单的分子生物学连接、扩增等实验，获得的LMP文库两端带有测序引物序列，能够直接应用于二代测序。此外，由于二次环化后的片段中存在已知的限制性内切酶位点，能够快速分拣待测片段两端的序列，对测序数据进行有效筛选，去除嵌和序列。整个过程成本低，步骤简单，易于操作，重现性好。 

具体实施方式

现结合实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1   LMP文库的构建

1）首先将基因组DNA随机打断，并将打断的DNA进行末端缺口补齐修复；