[发明专利]一种面包乳杆菌菌株及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及一种微生物菌株，特别涉及一种面包乳杆菌菌株及其应用。

背景技术：

皂苷的毒性主要表现为溶血性，一般认为，溶血性是其苷元可以与红细胞壁上胆甾醇结合生成不溶于水的复合物沉淀，破坏细胞渗透压，使红细胞发生崩解，进而导致溶血现象。皂苷有无溶血活性与皂苷元有关，活性强弱与糖分子的大小、糖分子之间的连接、糖分子上的取代基等有关，此外还与皂苷的浓度有关。

茶皂素的结构如附图1所示，属于三萜类皂苷，由糖体、配基和有机酸组成。从分子结构看，茶皂素是一种非离子表面活性剂。其亲水基团是强电负性的含氧基团组成，这些基团集中在茶皂素的糖体配体，有机酸配体及皂苷配基的连接部位，构成亲水部分。其中配基是由非极性的碳氢环链构成，在水溶液中呈现憎水的倾向，成为亲油的主体，所以茶皂素的结构分为亲水和亲油两部分。Sobolewska等在发表于2010年9月(9卷，3期)《Phytochemistry Review》(植物化学评论)425-474页的《Saponins as cytotoxic agents：a review》(综述：皂苷--细胞毒素)一文中称利用酶解法去除皂苷的糖体配体，会降低皂苷的溶血性。酶水解工业化应用成本较高，如能利用微生物发酵来降低茶籽粕的毒性，将更有工业化应用前景。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种面包乳杆菌菌株，以及利用该菌株进行茶籽粕固态发酵脱毒的方法，经发酵脱毒后的茶籽粕溶血作用明显下降，降低了茶籽粕的毒性。

为解决上述问题，本发明采用以下技术方案：

一种面包乳杆菌菌株，所述菌株的分类命名为：面包乳杆菌(Lactobacillus crustorum)，保藏编号为CGMCC No.6304，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰两路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年6月28日。

所述面包乳杆菌菌株的16s rDNA碱基序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还公开了所述面包乳杆菌菌株的筛选和应用于茶籽粕发酵脱毒的方法，包括以下步骤：

1、种子培养：将所述面包乳杆菌菌株于MRS固体培养基上涂布，然后于37℃厌氧培养2-3天，挑取单菌落接种到种子培养基中，继续37℃培养24h，使菌液的OD₆₀₀值达到0.8，备用，所述种子培养基成分为：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母抽提物5.0g，纤维二糖20.0g，吐温-801ml，柠檬酸三铵2.0g，K₂HPO₄2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，MnSO₄·2H₂O 0.05g，蒸馏水1000ml。

2、茶籽粕9g，加入含葡萄糖1.5％(w/w)、半乳糖1.5％(w/w)和硫酸铵2％(w/w)的pH5.0的磷酸盐缓冲溶液7.2ml，混合均匀后高压灭菌备用，得到未发酵的固体培养基。

3、按接种量10％(菌液/茶籽粕，ml/g)将步骤1中经种子培养后的所述面包乳杆菌菌株接种于步骤2所述未发酵的固体培养基中，固液比1∶0.8(w/v)，37℃发酵36h，得发酵的固体培养基。

4、茶籽粕发酵脱毒：往步骤3中所述发酵的固体培养基中加入50ml70％(v/v)乙醇，80℃振摇4h，抽滤，滤液旋转蒸发浓缩，浓缩至干，将所得产物称重并用生理盐水配制成100μg/ml的茶皂素固形物溶液A，备用；往步骤2中所述未发酵的固体培养基中加入50ml 70％(v/v)乙醇，80℃振摇4h，抽滤，滤液旋转蒸发浓缩，浓缩至干，将所得产物称重并用生理盐水配制成100μg/ml的茶皂素固形物溶液B，作为对照，备用。

5、溶血实验验证发酵效果：

(1)取血：将肝素钠和装有生理盐水的盛血容器置于冰箱中冷藏15min以上；用75％(v/v)酒精对动物的取血部位进行消毒；用一次性注射器吸取少量的肝素钠溶液，抗凝1ml血液不少于15IU肝素钠；用注射器从动物静脉中取血后，去除针头，将血慢慢推到装有冰生理盐水的试管中，制得血样。

(2)血样处理：将所述血样于4℃冷冻离心，300rmp/5min；离心后去除上清液，保留沉淀，再加入少量4℃生理盐水，用移液枪轻吹，使血溶解；重复本步骤至所述血样上清无色，然后用生理盐水稀释到2％(v/v)，得稀释后的血样。