[发明专利]芘标记的单链DNA荧光探针及其制备方法

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种水溶性荧光聚电解质的合成方法以及利用这种聚电解质制备检测寡核酸序列的荧光探针的方法，属于功能高分子技术、分析化学和生物分析化学领域。

 

技术背景

功能高分子是在其大分子链中结合了特定的功能基团，或大分子与具有特定功能的其他材料进行了复合，或者二者兼而有之而形成的具有某种特定功能的高分子材料，其在生物分析化学领域，尤其是在生物大分子检测方面的应用已经引起国内外学者的密切关注。核酸碱基序列的特异性识别是当前国际研究热点，而利用具有荧光特性的功能高分子作为荧光探针对核酸进行特异性识别已经取得了一些不错的效果。日本Saito教授将荧光基团芘标记到一个线性单链核酸上形成核酸探针，当与碱基互补配对的单链靶核酸杂化时表现出较强荧光光谱，当与碱基不互补配对的单链靶核酸杂化时表现出相对较弱的荧光光谱，由此来特异性识别核酸序列（J. Am. Chem. Soc., 2004, 126, 4820）。王国杰教授曾经报道过芘标记HNA和RNA的线性RNA探针，当与互补链杂化时，在荧光光谱上会出现芘单体峰的增强及激基缔合物峰的消失，根据这种明显的荧光变化来特异识别核酸序列（ChemBioChem., 2009, 10, 1175）。另外一种荧光基团标记的探针是非线性的探针称为分子信标，其核酸结构为发卡式且茎端两端分别接有荧光基团和淬灭基团，它可以提高错配目标的热识别及降低假阳性信号的风险，且在基因筛检、生物传感器的发展、生物芯片结构及单核苷酸多态性的检测方面都有很好的应用，所以受到很多学者的广泛关注（Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 856; Analyst. 2005, 130, 350; Langmuir. 2008, 24, 12138）。但是所有像以上说介绍的标记型荧光探针都是通过共价键将荧光基团连接到核酸分子链上，其合成操作比较复杂。近些年许多学者开始将目光转向用接有荧光基团的共轭聚电解质制备荧光探针来特异性检测核酸序列。He教授等人报道过用一种共轭聚电解质作为检测传感器来检测多链DNA的杂化（J. Am. Chem. Soc., 2009, 131, 3432）。Gaylord等报道了一种生物传感器，它是由含有一种共轭聚电解质和一种单链DNA的水溶液构成，当检测到特征波长的发射光线时标明含有特定序列的核酸链（J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 896）。

 

发明内容

本发明的目的在于合成一种水溶性的阳离子聚电解质芘功能化的聚4-乙烯基吡啶，并用该聚电解质和两种类型的单链寡聚核苷酸制备复合探针来检测目标DNA特定的碱基序列。

本发明特点在于共轭聚电解质聚4-乙烯基吡啶的合成方法容易操作，用其制备DNA复合探针的原理也很简单，且探针的检测原理与其他报道过的探针原理有所创新，是根据荧光基团芘嵌插到核酸双链结构与否的荧光变化来检测DNA的。

本发明是通过以下技术方案来实现的：本发明利用芘甲醇和三溴化磷的置换反应来制备芘甲溴，并将之按1:10的单体摩尔比接枝到聚4-乙烯基吡啶上，再用溴代正丁烷质子化，得到具有水溶性的阳离子聚电解质目标产物。该产物分别于直链和发卡式结构的单链DNA作用形成新型的复合DNA荧光探针。

本发明的芘标记的聚4-乙烯基吡啶聚电解质的合成及其在DNA探针制备中的应用的具体步骤包括：

（1）荧光基团芘甲溴分子的制备：

冰点温度下将芘甲醇溶于三氯甲烷中，将摩尔量是芘甲醇的1/2倍的三溴化磷加入该溶液，冰浴搅拌12个小时，然后加入饱和碳酸氢钠水溶液至中性，分层，取有机层进行蒸馏，重结晶，并干燥得到芘甲溴；

（2）将芘甲溴接枝到聚4-乙烯基吡啶上：

将聚4-乙烯基吡啶溶于三氯甲烷中，再加入适当摩尔量的芘甲溴，68℃下搅拌、回流24小时，然后将反应液缓慢滴加入四氢呋喃中得到沉淀，过滤，洗涤，干燥后得到中间产物；

（3）用溴代正丁烷进一步接枝到中间产物：

将中间产物溶于乙醇，并加入5倍于聚4-乙烯基吡啶单体摩尔量的溴代正丁烷，85℃下搅拌、回流24个小时，然后将反应液缓慢滴加入四氢呋喃中得到沉淀，过滤，洗涤，干燥得到产物阳离子聚电解质。

（4）DNA复合探针的制备：