[发明专利]QC-PCR检测禽坦布苏病毒竞争模板的扩增引物、制备方法和禽坦布苏病毒检测试剂盒无效
| 申请号： | 201210368141.X | 申请日： | 2012-09-27 |
| 公开（公告）号： | CN102839226A | 公开（公告）日： | 2012-12-26 |
| 发明（设计）人： | 张琳;袁朋;张秀美;胡北侠;许传田;杨少华;徐敏丽 | 申请（专利权）人： | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 |
| 主分类号： | C12Q1/70 | 分类号： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12N15/10;C12R1/93 |
| 代理公司： | 济南泉城专利商标事务所 37218 | 代理人： | 李桂存 |
| 地址： | 250100 *** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | qc pcr 检测 禽坦布苏 病毒 竞争 模板 扩增 引物 制备 方法 试剂盒 | ||
1.一种QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的扩增引物，其特征是核苷酸序列如下：
引物1：5’-ATGACTGACACNACTCCNTTTG-3’，
引物2：5’-CCNARCCACATRWACCATTYTCHCTYTTBCCCATCATGTT-3’。
2.一种QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的制备方法，其特征是包括以下步骤：
（1）提取禽坦布苏病毒RNA，进行反转录得到禽坦布苏病毒的cDNA一链；
（2）进行PCR扩增，扩增体系中含有步骤（1）得到的cDNA一链、引物1和引物2，胶回收得到QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板；
引物1核苷酸序列：5’-ATGACTGACACNACTCCNTTTG-3’，
引物2核苷酸序列：5’-CCNARCCACATRWACCATTYTCHCTYTTBCCCATCATGTT-3’。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述PCR扩增体系组成：10×Ex Taq buffer 2.5μL，2.5mM的dNTP2μL，引物1和引物2各0.5μL，Ex Taq 酶0.5μL，cDNA一链0.5μL, ddH2O补足25μL；
引物1和引物2的浓度各为100pmol/μL；
cDNA一链浓度为2.5ng/μL；
Taq 酶浓度为5U/μL。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于所述PCR扩增反应条件：98℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸40s, 30个循环；再72℃延伸10min，4℃终止反应。
5.一种禽坦布苏病毒检测试剂盒，其特征是含有8个子PCR扩增体系，每个PCR扩增体系组成为：10×Ex Taq buffer 2.5μL，2.5mM 的dNTP 2μL，引物1和引物3各0.5μL，Ex Taq 酶0.5μL，竞争模板0.5μL，ddH2O补足24.5μL；
引物1核苷酸序列：5’-ATGACTGACACNACTCCNTTTG-3’，
引物3核苷酸序列：5’-CCNARCCACATRWACCA-3’；
引物1和引物3的浓度各为100pmol/μL；
8个子PCR扩增体系竞争模板的浓度，自4×109-4×102竞争模板/扩增体系以10倍的浓度梯度设置；
Taq 酶浓度为5U/μL。
6.根据权利要求5所述的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其特征是使用时向PCR扩增体系中加入待检样品病毒cDNA 0.5μL。
7.根据权利要求6所述的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其特征是PCR反应条件为：98℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸40s, 30个循环；再72℃延伸10min，4℃终止反应。
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