[发明专利]QC-PCR检测禽坦布苏病毒竞争模板的扩增引物、制备方法和禽坦布苏病毒检测试剂盒

说明书

技术领域    

本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的引物，还涉及此竞争模板的制备方法，还涉及禽坦布苏病毒检测试剂盒。

背景技术   

2010年4月以来，在我国山东、江苏、 浙江、广西等养禽集中区域爆发了一种疾病，以种禽产蛋严重下降、肉禽出现神经症状为特点，后证实是由坦布苏病毒（Tembusu virus）所引起, 目前研究人员已先后在鸭、鹅、鸡、麻雀等体内分离到该病毒，同时也已证实该病毒在养禽区域定植。禽坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属蚊媒病毒类恩塔亚病毒群，是一种新发黄病毒，给中国的养禽业带来了极大的经济损失。

禽坦布苏病毒病毒活力较低，滴度下降快，造成病毒滴度不稳定，所以给病毒的定量带来了一定的困难。目前对禽类病毒定量的方法主要是荧光定量PCR和半数鸡胚感染量（EID₅₀）的测定，但前者存在仪器昂贵、使用成本高和易污染等方面的缺点；而后者则需要将病毒接种SPF鸡胚或者鸭胚，统计不同病毒稀释度对胚体的感染量，一般需要5-6天时间，耗时长、工作量大，加之禽坦布苏病毒活力低，所以更不适合使用EID₅₀进行含量的测定。此外，一般的PCR检测方法只能进行定性的检测，而不能定量，不能满足部分实验的要求。

发明内容   

为了解决以上禽坦布苏病毒检测中存在的仪器昂贵、使用成本高、易污染、耗时长、工作量大、禽坦布苏病毒活力低的问题，本发明提供了QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的扩增引物。

本发明还提供了上述QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的制备方法。

本发明的另一个目的是提供禽坦布苏病毒检测试剂盒。

本发明是通过以下步骤实现的：

一种QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的扩增引物，核苷酸序列如下：

引物1：5’-ATGACTGACACNACTCCNTTTG-3’，

引物2：5’-CCNARCCACATRWACCATTYTCHCTYTTBCCCATCATGTT-3’。

一种QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的制备方法，包括以下步骤：

（1）提取禽坦布苏病毒RNA，进行反转录得到禽坦布苏病毒的cDNA一链；

（2）进行PCR扩增，扩增体系中含有步骤（1）得到的cDNA一链、引物1和引物2，胶回收得到QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板；

引物1核苷酸序列：5’-ATGACTGACACNACTCCNTTTG-3’，

引物2核苷酸序列：5’-CCNARCCACATRWACCATTYTCHCTYTTBCCCATCATGTT-3’。

所述PCR扩增体系组成：10×Ex Taqbuffer 2.5μL，2.5mM的dNTP2μL，引物1和引物2各0.5μL，Ex Taq 酶0.5μL，cDNA一链0.5μL, ddH₂O补足25μL；

引物1和引物2的浓度各为100pmol/μL；

cDNA一链浓度为2.5ng/μL；

Taq 酶浓度为5U/μL。

所述PCR扩增反应条件：98℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸40s, 30个循环；再72℃延伸10min，4℃终止反应。

一种禽坦布苏病毒检测试剂盒，含有8个子PCR扩增体系，每个PCR扩增体系组成为：10×Ex Taqbuffer 2.5μL，2.5mM 的dNTP 2μL，引物1和引物3各0.5μL，Ex Taq 酶0.5μL，竞争模板0.5μL，ddH₂O补足24.5μL；

引物1核苷酸序列：5’-ATGACTGACACNACTCCNTTTG-3’，

引物3核苷酸序列：5’-CCNARCCACATRWACCA-3’； 

引物1和引物3的浓度各为100pmol/μL；

8个子PCR扩增体系竞争模板的浓度，自4×10⁹-4×10²竞争模板/扩增体系以10倍的浓度梯度设置；

Taq 酶浓度为5U/μL。

所述的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其特征是使用时向PCR扩增体系中加入待检样品病毒cDNA 0.5μL。