[发明专利]人胚肺成纤维细胞株及利用其生产手足口病毒疫苗的方法

权利要求书

1.一株人胚肺二倍体成纤维细胞株，其特征在于,该细胞株为人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201055。

2.一种生产二价手足口病毒灭活疫苗的制备方法，该方法包括如下步骤：

A.在细胞培养容器中培养保藏号为CCTCC  C201055的人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2，得到的培养状态的Walvax-2细胞；

B.分别接种手足口病毒EV71和手足口病毒COX. A16至Walvax-2细胞，并分别培养EV71和COX.A16病毒感染的Walvax-2细胞；

C.当细胞出现典型病变时分别收获细胞病毒液；

D.用甲醛分别灭活病毒；

E.去除细胞碎片，浓缩病毒，并去除杂质；

F.将手足口病毒EV71和COX. A16灭活浓缩病毒液按1:0.5～1:1.5比例混合，并加氢氧化铝佐剂，分装，成为二价手足口病毒灭活疫苗。

3.根据权利要求2中所述方法，其中利用含体积百分比为2％～10％新生牛血清的MEM营养液在步骤A中培养Walvax-2细胞形成单层。

4.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤A中以1:2～1:4的分种率接种细胞，细胞生长至对数生长期，覆盖85～95%培养容器的表面。

5.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤B中加入到Walvax-2细胞中的手足口病毒EV71或手足口病毒COX. A16感染复数为0.001～0.1 MOI。

6.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤B中培养手足口病毒EV71或手足口病毒COX. A16的维持液为无血清的MEM营养液。

7.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤C中细胞出现典型病变达到75%-95%时，收获细胞病毒液。

8.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤D中加入1:2000～1:6000的甲醛灭活，40℃灭活72小时～120小时。

9.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤E中灭活后的病毒在4℃条件下离心，8000～10000rpm，5～10min 收集上清液；采用超滤膜超滤浓缩病毒液10倍，补加缓冲液超滤浓缩，重复2～5次；最后一次浓缩至原体积的1/50，收集浓缩液，并清洗滤膜，在Sepharose-4FF凝胶过滤柱进一步去除杂质。

10.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤F中每毫升二价灭活疫苗加氢氧化铝佐剂1.0～1.2mg。

11.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤F中每毫升二价灭活疫苗含纯化的灭活EV71病毒5～80μg。

12.根据权利要求2中所述方法，其中在步骤F中每毫升二价灭活疫苗含纯化的灭活COX. A16病毒5～80μg。

13.根据权利要求2中所述方法，该方法包括如下步骤：

A.在细胞培养容器中培养保藏号为CCTCC  C201055的人胚肺二倍体成纤维细胞株Walvax-2，得到的培养状态的Walvax-2细胞；

B.分别接种感染复数为0.01 MOI手足口病毒EV71和手足口病毒COX. A16至Walvax-2细胞，并分别培养EV71和COX.A16病毒感染的Walvax-2细胞；

C.当细胞出现典型病变达75～95%时分别收获细胞病毒液；

D.用1:4 000甲醛在40℃，96小时分别灭活病毒； 

E.去除细胞碎片，浓缩病毒，并去除杂质；

F.将手足口病毒EV71和COX. A16灭活浓缩病毒液按1:0.5～1:1.5比例混合，每毫升二价灭活疫苗加氢氧化铝佐剂1.2mg，分装，成为二价手足口病病毒灭活疫苗。

14.权利要求1中所述Walvax-2细胞株在制备二价手足口病毒灭活疫苗中的应用。