[发明专利]人胚肺成纤维细胞株及利用其生产手足口病毒疫苗的方法

说明书

发明所属领域：

本发明属于细胞和病毒培养技术领域，具体地说，本发明涉及人胚肺二倍体成纤维细胞株，细胞株在制备二价手足口病毒灭活疫苗中的应用，以及用该细胞生产手足口病毒二价灭活疫苗的方法。

背景技术：

病毒性疫苗可有效预防病毒引起的人类各种传染性疾病。如：狂犬、流脑、乙肝、麻风腮、脊髓灰质炎、手足口等流行性传染病。病毒性疫苗生产的细胞基质主要为人胚肺二倍体细胞（以下简称“二倍体细胞”）、传代细胞和原代细胞三种。而细胞株作为培养基质，其质量的优劣，直接影响疫苗的质量和产量，尤其是疫苗的安全性。人们在实践中迫切盼望能寻找到一种经过标化的安全的细胞基质来生产病毒性疫苗，人胚肺二倍体成纤维细胞株具有这种潜能。

人二倍体细胞是指分离正常人体组织细胞后，在体外培养的细胞。细胞株来源于正常人胚胎或者其他组织的细胞群体，其染色体数目与原供体细胞染色体数目相同，无异种移植致癌性，无外源因子污染，在正常情况下具有有限生命期，故属有限生命细胞株。如果组织材料取材于人胚肺，这种细胞通常叫人胚肺二倍体成纤维细胞株或人胚肺成纤维细胞株。

有代表性的人胚肺二倍体成纤维细胞株包括国外的MRC-5细胞株（ATCCCCL171），WI-38细胞株（ATCC CCL75），HEL299细胞株（ATCC CCL137），LBHEL（KCTC0127BP），IMR-90以及国内KMB-17，2BS等。这些细胞株的信息如下：

1）WI-38细胞株：由美国Wistar研究所建立的人二倍体细胞株。WI-38是1962年从Swedish医院人工流产的一个3月龄女性胎儿（家庭无肿瘤史）的肺组织建立的。1：2分种共传代48次(Hayflick.L.1965.EXP.Cell Res，37：614)。WI-38在世界各国广泛使用，已在许多国家应用于病毒性疫苗生产。WI-38是国际上第一个经过标化的安全的二倍体细胞株。

2）MRC-5细胞株：由英国国家医学研究院的Jacobs等于1966年从一个27岁精神异常，而其家庭遗传史正常的孕妇，人工流产14周胎儿的肺组织建立的细胞株，总寿命共48次群体分裂。MRC-5经反复检定证明其生物学性状达到了制备病毒性疫苗细胞株的国际标准（J.P.Jacobs etal,Nature1970(227):168-170）。

3）LBHEL（KCTC0127BP）细胞株：由韩国株式会社LG化学的金政民等从一个20周龄的雌性胚胎的肺组织建立的细胞株，其生长速度比MRC-5快2倍，相同单位表面积上的细胞产量比MRC-5多1.7倍，对水痘带状疱疹减毒易感性是MRC-5细胞的10倍（中国专利97190080.9），但水痘带状疱疹病毒在该细胞上扩增时，细胞病变快，病毒滴度低。且仅见该细胞对麻疹病毒，风疹病毒，甲型肝炎病毒及水痘带状疱疹病毒具有易感性。

4）KMB-17细胞株：由昆明医学生物研究所郭仁等建立，1974年建立了KMB-17人二倍体细胞株。细胞来源于一位20岁健康孕妇第二胎，4月龄的女性胎儿，表型正常。从冻存后细胞的生物学结果看，细胞分裂、传代寿命、染色体分析都未发现明显改变。KMB-17至少对100多种病毒敏感。已成功用于甲肝灭活疫苗的生产(郭仁等，中国医学科学院学报，1981，Vol3,226-229.)。

5）2BS细胞株：该细胞株由北京生物制品研究所建株，来源于3月龄女性胎儿，为第一胎，双亲无肿瘤史和慢性疾病，家族无先天疾病和遗传性缺陷。细胞培养性状，稳定性，活力都表现良好。该株细胞应用于小儿麻痹、乙脑、麻疹、痘苗、腮腺炎等疫苗的研究。已用于甲肝灭活疫苗的生产。(药品与生物制品（内部资料）1977，2(6):335-342)

手足口病（Hand foot and mouth disease HFMD）是一种常见及轻微、但传染度颇高的传染病，可由多种的肠道病毒引致，常见于夏天及初秋时分。此病多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿如果病情发展快，会导致死亡。引发手足口病的肠道病毒有20多种，其中肠道病毒71型EV71和柯萨奇病毒(CoxAsckie virus)COX.A16是主要流行毒株，交替或共同出现引起HFMD感染，爆发大规模流行。

手足口病毒属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属。肠道病毒无脂质胞膜，故乙醇对其无作用，在pH3~9的条件下稳定，不耐强碱，在4℃可存活一年以上，-20℃及外部环境下可长期存活，不耐高温，温度大于56℃失去活性，各种氧化剂、甲醛能使其灭活。