[发明专利]一种基于化学衍生的尿液中甾体激素的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学和医学领域，是一种基于化学衍生技术用于提高尿液中甾体激素检测灵敏度的新方法。

背景技术

甾体激素，又称类固醇激素，是一类具有环戊烷多氢菲母核的四环脂肪烃化合物。甾体类激素在人体内具有极其重要的生理作用，表现在维持生命，调节性功能，机体的生长发育、免疫调节、皮肤功能等各个方面。当体内的甾体激素代谢失衡时，会导致各种各样的疾病。近年来研究还发现甾体激素在前列腺癌、乳腺癌、肝癌等肿瘤的发生发展中具有重要作用。因此，测定人体体液中一系列的甾体激素（即甾体激素代谢组），即通过代谢组学的方法检测甾体激素，对于研究疾病的发生发展机制、人体对疫病的应答以及更好的个性化的给药治疗方案都具有积极的意义。

在以往的甾体激素检测中，往往是通过免疫分析（immunoassay）的方法对单个激素进行检测。但是免疫分析的方法由于基质干扰效应和批次之间较大的差异性，使得检测的特异性、准确性和重复性均较低。气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）可以提高甾体激素检测的特异性，而且可以进行多种激素的同时检测。但是气相色谱-质谱联用技术由于前处理比较繁琐而且灵敏度相对较低，在临床检测中并不常用。液相色谱-质谱联用技术是目前较理想的对甾体激素代谢组进行检测的技术。

直接（不经过衍生化）液相色谱-串联质谱检测方法（LC-MS/MS）是目前较为常用的方法，具有前处理较为简单，方法稳定可靠的优点，但是由于不同的甾体激素在离子化过程中的差异较大，许多甾体激素在电喷雾离子源中的离子化效率很低，造成其检测灵敏度很差。因此在实际检测中，只有部分甾体激素可以被高灵敏度检测和定量。衍生化方法是提高离子化效率一种比较常用的方法。目前通过丹磺酰氯衍生化的方法可以提高雌激素的检测灵敏度，并被用于尿液和血浆中甾体激素的检测。但是丹磺酰氯对分子结构中不含酚羟基的雄激素、皮质激素和孕激素不能进行衍生化，使其适用范围不能覆盖整个甾体激素代谢组。进一步对已有衍生化方法的文献报道进行检索，也没有一种可以覆盖整个甾体激素代谢组的方法。针对上述情况，我们提出了一种有望覆盖整个甾体激素代谢组的新的衍生化技术。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提供一种基于化学衍生的尿液中甾体激素的检测方法，使其用于检测人体尿液中甾体激素，为了解机体的生理过程、疾病的发生发展机制、机体对病变和药物的应答以及个性化治疗方案提供有效的信息和依据。该方法具有灵敏度高、精确、重复性和稳定性好的优点。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

具体步骤如下，

第一步：收集尿液，离心后保存。

所述保存，其温度-20℃。

第二步：取第一步得到的尿液，采用SPE柱提取其中的甾体激素。

所述尿液，其用量为500μL，所用的SPE柱为Waters Oasis HLB柱（30mg）。SPE洗脱步骤如下：

1）SPE柱先用2mL甲醇平衡；

2）然后用2mL去离子水水洗；

3）上样：在500μL尿液中加入50μL水和450μL甲醇，并将这1mL的溶液上样至SPE柱上；

4）淋洗：正压条件下用1mL45％甲醇溶液淋洗3次；

5）洗脱：正压条件下用1.5mL90％甲醇溶液进行洗脱。

第三步：过SPE柱的洗脱液进行冷冻干燥；

第四步：进行衍生化反应：在冷冻干燥的离心管内，加入4-二甲氨基苯甲酸（DMAB），4-二甲氨基吡啶（DMAP）和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（EDC）的二氯甲烷溶液，涡旋混匀，转移至玻璃进样小瓶中，盖上瓶盖密封，水浴加热进行衍生化，然后蒸干二氯甲烷溶液。

所述DMAB浓度为2mg/mL，溶液为二氯甲烷，体积为80μL。

所述DMAP浓度为2mg/mL，溶液为二氯甲烷，体积为80μL。

所述EDC浓度为5mg/mL，溶液为二氯甲烷，体积为80μL。

所述水浴加热温度为75℃，水浴时间为5小时。

所述蒸干二氯甲烷溶液温度为45℃，时间约为10分钟。

第五步：加溶解液涡旋溶解残渣，等待液相色谱-质谱联用进样分析。

所述溶解残渣的溶剂为50％乙腈/水溶液，体积200μL。

所述溶解残渣的涡旋时间为1分钟。

第六步，进行液相色谱-质谱联用检测分析甾体激素。