[发明专利]一种定量检测MPL基因W515位点突变的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域的荧光定量PCR技术，具体涉及一种定量检测MPL基因W515位点突变的试剂盒。 

背景技术

骨髓增殖性疾病（myeloproliferative diseases，MPD）是骨髓组织持续异常增殖之后，造成红细胞和血小板过多，以及骨髓纤维化问题的疾病。根据2008年WHO（World HealthOrganization，世界卫生组织）的修订，将骨髓增殖性疾病改为骨髓增殖性肿瘤（myeloproliferative，MPN）。MPN中包括真性红细胞增多症（Polycythernia Vera，PV），原发性血小板增多症（Essential Thrombocytosis，ET）和原发性骨髓纤维化（primary myelofibrosis，PMF），它们均是血细胞过度增殖的疾病，如若不及时治疗，最终会发展成为急性粒细胞性白血病。因此，早期快速诊断对病人疾病的发生发展起关键性作用。 

2008年WHO修订MPN诊断标准的依据是多数患者都具有JAK2基因突变，主要是JAK2基因V617F和JAK2基因外显子12突变。研究表明JAK2基因V617F是诊断为PV的敏感指标，也见于50%的ET和PMF中。但是不能排除JAK2基因V617F阴性却患有MPN的可能性。随后在JAK2V617F阴性的MPN患者中发现促血小板生成素受体MPL基因突变，包括MPL基因W515L位点突变和W515K位点突变。该基因是骨髓增殖性白血病病毒同源性致癌基因，属于促红细胞生成素超级家族，可促使促血小板生成素配体（Thromboietin，TPO）全身造血和巨核细胞生长与分化，此基因位于染色体1q34并包含12个外显子。 

2006年，人体MPL基因W515L位点突变是在JAK2基因V617F阴性的PMF中被发现，突变位于第10外显子中，在1544号核苷酸处G转变成T，致使横跨膜区域515密码子有色氨酸转变成亮氨酸。此后，又发现在1543与1544处核苷酸由TG转变为AA即MPL基因W515K位点突变。尽管之后又在第10外显子中发现其它突变，但是只有MPL基因W515位点的突变会诱导模仿JAK2基因V617F的功能，发展成MPN。 

MPL基因W515L位点和MPL基因W515K位点的功能获得性突变率在PMF和ET中分别为10%和3%，而在PV中从未出现。因此，MPL基因W515L突变和W515K位点突变 主要用于诊断PMF和ET。在JAK2基因V617F阴性的患者中，检测MPL基因W515L突变和W515K位点突变有助于MPN的诊断。使用等位基因特异性荧光定量PCR（Polymerase ChainReaction，聚合酶链式反应）检测技术，其敏感性显著高于直接测序。实时荧光定量PCR技术实现了PCR从定性到真正意义的定量的飞跃，为人类疾病基因的定量检测提供了一个行之有效的检测工具，与普通PCR相比具有特异性增强、灵敏度提高和检测快速、降低了污染等特点，但目前尚未有实时荧光定量PCR方法检测MPL基因W515位点突变试剂盒的相关报道。 

发明内容

为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种检测MPL基因W515L位点突变和MPL基因W515K位点突变的试剂盒。所述技术方案如下： 

本发明实施例提供了一种检测MPL基因W515位点突变的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括MPL基因W515L位点突变特异性引物和MPL基因W515K位点突变特异性引物中的至少一种和内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中： 

MPL基因W515L位点突变特异性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示； 

MPL基因W515L位点突变特异性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示； 

MPL基因W515L位点突变特异性Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示； 

MPL基因W515K位点突变特异性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示； 

MPL基因W515K位点突变特异性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示； 

MPL基因W515K位点突变特异性Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示； 

ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；