[发明专利]一种一步法乙肝病毒PreS1抗原酶联免疫测定试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物制剂技术领域。具体涉及一种一步法乙肝病毒前S1(PreS1)抗原(Ag)酶联免疫测定试剂盒及制备方法。 

背景技术

我国属于乙型肝炎病毒高发区，乙型肝炎已经成为危害我国人民身体健康的社会公众性问题，乙型肝炎病毒血清标志物(HBVM)作为乙型肝炎病毒诊断的常规项目已不能满足临床，HBV-DNA、病毒表面抗原(HBsAg)、乙肝病毒前S1(PreS1Ag)抗原都作为HBV在人体内感染和复制的证据。 

HBV为嗜肝DNA病毒，由一个不完全双链DNA组成，约3200个氨基酸，有4个开放读码框为S区、C区、P区、X区。S基因区又可分成三段，从上游开始依次为前S1(preS1)区、前S2(preS2)区和S区。PreS1原具有较强的免疫原性，是由108或119个氨基酸组成。HBV以前S1区氨基酸21-47片段作为结合部位结合肝细胞，只要这一片段完好就有传染性和高度的免疫源性。PreS1抗原出现在急性乙型肝炎病毒感染的最早期，比HbeAg出现早，是早期传染性的标志。乙型肝炎病毒的大量复制，导致大量的PreS1Ag表达，刺激机体产生较强的免疫应答，从而导致大量肝细胞损伤，并认为PreS1作为HBV的外壳蛋白成份，在HBV感染宿主细胞的过程中起着关键的作用，最重要的介导部位是前S1蛋白的氨基(AA)21-47片段，变异的病毒只要这一区段完好就有传染性。 

PreS1在病毒感染机体的整个周期中，PreS1的独特作用，使其能够较充分的反应机体的体液免疫状况，直至病程的转阴过程，如急性肝炎时PreS1Ag阴转是病毒清除的最早迹象，反之，PreS1Ag持续阳性，急性肝炎将发展至慢性肝炎。因此，PreS1Ag与HBV-DNA在反映乙肝病毒复制有良好的一致性。PreS1Ag较HBeAg更敏感地反映HBV复制的情况。 

但是目前普遍使用双抗体夹心法检测乙肝病毒PreS1抗原，具有很好的特异性，但是单纯利用无力吸附吧单克隆抗体或者多克隆抗体吸附在酶标板上会存在单抗使用量大，活性损失大，特别是批间精密度差等缺点，而将亲和素包被在板上，再加入生物素化的抗体，则可以很好的解决这一问题，其不但可以减少批间差，而且可以在检测过程中可一步直接加入样品血清和酶标记抗体进行反应，形成固相亲和素-生物素话抗体-乙肝病毒PreS1抗原-酶标抗PreS1抗原抗体复合物，然后加入底物缓冲液甲和乙进行反应，就可以定量分析血清中的乙肝病毒PreS1抗原的含量。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于解决传统酶标板批间差不足的问题，设计并建立了一步法PreS1抗原的检测试剂盒。 

本发明提供了一种“一步法PreS1抗原酶联免疫测定试剂盒”，该试剂盒是包括主要成分亲和素预先包被后加入生物素化抗乙肝病毒PreS1单克隆抗体或抗HBS抗体的酶标板包被反应条、酶标记前S1抗体、阳性对照液一支、阴性对照液一支、20倍浓洗涤液1瓶、底物缓冲液甲1瓶、底物缓冲液乙1瓶及终止液(2N H2SO4)1瓶组成。 

1、抗体制备： 

(1)利用HBV-DNA重组PreS1 Ag基因片段通过原核表达或者真核表达制备抗原； 

(2)制备抗体的制备和纯化：用上述重组抗原免疫豚鼠，得抗PreS1抗血清或免疫Balb/C小鼠得阳性鼠脾细胞与骨髓瘤；细胞融合成杂交瘤细胞，筛选阳性克隆建株，得腹水；抗血清或腹水用盐析、离子交换层析、或者亲和层析法进行纯化，得纯抗PreS1抗体，其纯度95％以上。 

(3)用亲和素先包被酶标板，并加入生物素标记的抗乙肝病毒PreS1单克隆抗体或抗HBS进行二次包被反应，制成抗体预包被反应条48-96孔； 

(4)辣根过氧化物酶(HRP)与纯化的抗乙肝病毒PreS1抗体酶联，制成酶标抗体； 

(5)配制阳性对照液、阴性对照液； 

(6)配制20倍浓缩洗液； 

(7)配制底物缓冲液甲； 

(8)配制底物缓冲液乙； 

(9)配制终止液(2N H2SO4)。 

(10)分装上述试剂盒除预报被板其余七种成分，按需要分装在小瓶或尖底离心管中； 

(11)检定试剂盒的特异性、灵敏度、精密性、稳定性合格； 

(12)组装成成品。 

2、本发明的试剂盒在使用时可以如下操作： 

(1)取出已包被条孔或板，恢复至室温。 

(2)配液：将浓缩洗涤液(20X)用蒸馏水或去离子水稀释备用(20倍浓洗涤液1ml+19ml蒸馏水即为工作液)。