[发明专利]注射用重组卵泡抑素制剂及制备方法

权利要求书

1.一种注射用重组卵泡抑素制剂，所述制剂包含：

重组卵泡抑素的冻干粉、甘露醇、甘氨酸。

2.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于：所述制剂以每支计算包含：

1.0-5.0mg重组卵泡抑素的冻干粉；

1％-5％重量百分比的甘露醇；

0.2％-1％重量百分比的甘氨酸。

3.根据权利要求1所述的制剂，其特征在于：所述制剂以每支计算包含：2mg±0.2mg重组卵泡抑素的冻干粉；

1％重量百分比的甘露醇；

0.2％重量百分比的甘氨酸。

4.根据权利要求1-3任一所述的制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(A1)建立菌种库：

取出原始菌种，在kan抗性的LB平板上划线，并在恒温箱培养，挑取单克隆菌于LB液体培养基中，振荡若干时间，取菌液和等量灭菌甘油混匀，分装并保存；传代若干次后，菌种应重新激活培养保存；

(A2)种子液培养；从保存的菌种管子用接种环在kan抗性LB平板上划线，培养若干时间，挑取单克隆到LB液体培养基中，在恒温摇床上培养至OD600为0.4-0.8之间；

(A3)发酵培养；

在发酵培养基中培养，并以一定速度补料，当OD600为7-12时，加入IPTG诱导剂，继续发酵培养若干时间后，终止培养；

(A4)收集和破碎菌体； 

收集菌体：诱导完的菌液用离心机离心；

破碎菌体：将离心后菌体用缓冲液悬浮均匀，使用细胞破碎机进行碎菌，再用离心机离心，收集上清液，即粗制重组卵泡抑素蛋白溶液；

(A5)目的蛋白纯化：

将所述上清液通过镍离子亲和层析柱，用包含不同浓度咪唑的缓冲液进行清洗，洗脱的为重组蛋白粗制品；

再通过阴离子交换柱，用包含不同浓度Nacl的缓冲液进行清洗，洗脱的为重组蛋白精制品；

(A6)浓缩半成品：

通过过滤系统去除多余的盐和水，将液体浓缩至合适的体积，加入1-5％甘露醇和0.2-1％甘氨酸，混合均匀后过滤，即制成重组卵泡抑素半成品；

(A7)冷冻干燥：

将所述重组卵泡抑素半成品稀释，分装于西林瓶中，在冷冻干燥机上进行冻干处理若干时间，最后进行压盖、封口处理。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(A1)进一步包括如下步骤：

(B1)菌种进行以下鉴定，鉴定合格后投入生产：

形态特征观察：将所述菌种划线于kan抗性的LB平板，并培养，观察菌种克隆是否具有大肠杆菌典型的形状特征，是否有杂菌生长；

表达量检测：挑取单克隆菌，接种于1-3ml含kan的LB液体培养基，30-45℃摇床振荡1-5小时，检测OD600为0.4-0.6时，加入IPTG诱导，继续振荡3-4小时后收菌，经过SDS-PAGE检测蛋白表达量；

质粒检查：抽取质粒DNA，用限制性内切酶双酶切，检查酶切图谱与原始酶切图谱是否一致。

6.根据权利要求4所述的制备方法其特征在于：所述步骤(A1)进一步 包括以下步骤：

从-70℃冰箱取出原始菌种，在kan抗性的LB平板上划线，37℃恒温箱培养16小时，挑取单克隆菌于LB液体培养基中，37℃摇床振荡12小时，取菌液和等量30％灭菌甘油混匀，使甘油终浓度为15％；用灭菌后的1.5ml EP管分装数管，保存于-70℃冰箱；传代3次后，菌种应重新激活培养保存。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(A2)进一步包括以下步骤：

从保存的菌种管子用接种环在kan抗性LB平板上划线，在37℃培养16小时，挑取单克隆到LB液体培养基中，在恒温摇床上培养至OD600为0.4-0.8之间，即可用来接种发酵培养使用。