[发明专利]注射用重组卵泡抑素制剂及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及卵泡抑素，尤其涉及一种注射用重组卵泡抑素制剂及其制备方法。

背景技术

卵泡抑素(Follistatin)是1987年由Robertson和Ueno分别从牛和猪的卵泡液中分离出的一种富含半胱氨酸的糖基化单链多肽，对卵泡刺激素有较强的抑制作用。卵泡抑素分布较为广泛，在不同组织中均能检测到卵泡抑素。目前发现卵泡抑素至少有32KD，35KD，39KD三种不同的分子形式。

卵泡抑素(Follistatin)作为Activin的结合蛋白，它可以通过Activin/Follistatin系统来调节动物的生殖活动。近年来的实验表明，卵泡抑素可以通过其作用系统，参与机体多种生理机能的调节，对卵巢颗粒细胞分化、胚胎发育、红细胞生成和成骨细胞功能的调节均起重要的作用，具有重要的生物学意义。

卵泡抑素(Follistatin)可用于治疗肌肉疾病和病症，尤其是肌肉组织的增加将有利于治疗的疾病，也可用于治疗与代谢、脂肪组织及骨变性相关的疾病和病症。

发明内容

本发明解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种表达量高、活性高、纯化工艺简单的重组卵泡抑素制备工艺；以及一种不含保护剂和防腐剂、有效期长的注射用重组卵泡抑素制剂配方。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种注射用重组卵泡抑素制剂，所述制剂包含：

重组卵泡抑素的冻干粉、甘露醇、甘氨酸。

根据上述的制剂，优选的，所述制剂以每支计算包含：

1.0-5.0mg重组卵泡抑素的冻干粉；

1％-5％重量百分比的甘露醇；

0.2％-1％重量百分比的甘氨酸。

根据上述的制剂，优选的，所述制剂以每支计算包含：

2mg±0.2mg重组卵泡抑素的冻干粉；

1％重量百分比的甘露醇；

0.2％重量百分比的甘氨酸。

本发明的目的还通过以下技术方案实现的：

上述的制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(A1)建立菌种库：

取出原始菌种，在kan抗性的LB平板上划线，并在恒温箱培养，挑取单克隆菌于LB液体培养基中，振荡若干时间，取菌液和等量灭菌甘油混匀，分装并保存；传代若干次后，菌种应重新激活培养保存；

(A2)种子液培养；从保存的菌种管子用接种环在kan抗性LB平板上划线，培养若干时间，挑取单克隆到LB液体培养基中，在恒温摇床上培养至OD600为0.4-0.8之间；

(A3)发酵培养；

在发酵培养基中培养，并以一定速度补料，当OD600为7-12时，加入IPTG诱导剂，继续发酵培养若干时间后，终止培养；

(A4)收集和破碎菌体；

收集菌体：诱导完的菌液用离心机离心；

破碎菌体：将离心后菌体用缓冲液悬浮均匀，使用细胞破碎机进行碎菌，再用离心机离心，收集上清液，即粗制重细卵泡抑素蛋白溶液；

(A5)目的蛋白纯化：

将所述上清液通过亲和层析柱，用包含不同浓度咪唑的缓冲液进行清洗，洗脱的为重组蛋白粗制品；

再通过阴离子交换柱，用包含不同浓度Nacl的缓冲液进行清洗，洗脱的为重组蛋白精制品；

(A6)浓缩半成品：

通过过滤系统去除多余的盐和水，将液体浓缩至合适的体积，加入1-5％甘露醇和0.2-1％甘氨酸，混合均匀后过滤，即制成重组卵泡抑素半成品；

(A7)冷冻干燥：

将所述重组卵泡抑素半成品稀释，分装于西林瓶中，在冷冻干燥机上进行冻干处理若干时间，最后进行压盖、封口处理。

根据上述的制备方法，可选地，所述步骤(A1)进一步包括如下步骤：

(B1)菌种进行以下鉴定，鉴定合格后投入生产：

形态特征观察：将所述菌种划线于kan抗性的LB平板，并培养，观察菌种克隆是否具有大肠杆菌典型的形状特征，是否有杂菌生长；

表达量检测：挑取单克隆菌，接种于1-3ml含kan的LB液体培养基，30-45℃摇床振荡1-5小时，检测OD600为0.4-0.6时，加入IPTG诱导，继续振荡3-4小时后收菌，经过SDS-PAGE检测蛋白表达量；

质粒检查：抽取质粒DNA，用限制性内切酶双酶切，检查酶切图谱与原始酶切图谱是否一致。

根据上述的制备方法，优选的，所述步骤(A1)进一步包括以下步骤：