[发明专利]一种二氢乳清酸酶法制备α-天冬氨酰小肽的方法

权利要求书

1.一种二氢乳清酸酶法制备α-天冬氨酰小肽(1)的方法，其特征在于该方法包括下列步骤：

 

 1）以L-二氢乳清酸为原料，与氨基酸酯或小二肽类酯化合物在接肽试剂作用下进行接肽反应，形成L-二氢乳清酸小肽酯类化合物；

2）采用稀碱溶液处理L-二氢乳清酸小肽酯类化合物，水解酯键，暴露出末端羧基；

3）以二氢乳清酸酶或含有二氢乳清酸酶的菌体为催化剂，在弱碱性条件下水解暴露出末端羧基的L-二氢乳清酸小肽类化合物，形成N-氨甲酰化-α-天冬氨酰小肽化合物；

4）采用亚硝酸水解脱去N-氨甲酰化-α-天冬氨酰小肽化合物的氨甲酰基团即可获得α-天冬氨酰小肽类化合物。

2.根据权利要求1所述的二氢乳清酸酶法制备天冬氨酰小肽的方法，其特征在于所述的α-天冬氨酰小肽(1)的R₁基团为甘氨酸、L或D-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、氨基丁酸的残基；或者是L或D-甘氨酰-、丙氨酰-、缬氨酰-、亮氨酰-、异亮氨酰-、苯丙氨酰-、脯氨酰-、色氨酰-、丝氨酰-、酪氨酰-、半胱氨酰-、蛋氨酰-、天冬酰胺酰-、谷氨酰胺酰-、苏氨酰-、天冬氨酰-、谷氨酰-、赖氨酰-、精氨酰-、组氨酰-甘氨酸小肽的残基。

3.根据权利要求1所述的二氢乳清酸酶法制备天冬氨酰小肽的方法，其特征在于步骤1）中所述的氨基酸酯或小二肽类酯化合物为甘氨酸、L或D-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、氨基丁酸的α-酯；或者是L或D-甘氨酰-、丙氨酰-、缬氨酰-、亮氨酰-、异亮氨酰-、苯丙氨酰-、脯氨酰-、色氨酰-、丝氨酰-、酪氨酰-、半胱氨酰-、蛋氨酰-、天冬酰胺酰-、谷氨酰胺酰-、苏氨酰-、天冬氨酰-、谷氨酰-、赖氨酰-、精氨酰-、组氨酰-甘氨酸的α-酯中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的二氢乳清酸酶法制备天冬氨酰小肽的方法，其特征在于步骤1）中，所用的接肽试剂为DCC/HOBt、DIC/HOBt、DCC/HOSu和DCC/HOAt中的任意一种。

5.根据权利要求1所述的二氢乳清酸酶法制备天冬氨酰小肽的方法，其特征在于步骤3）中，所述含有二氢乳清酸酶的菌体为大肠杆菌K-12；所述的二氢乳清酸酶为含有二氢乳清酸酶基因pET-22b(+)-DHO-his质粒的重组菌株E.coli Rosetta(DE3)所表达、纯化的二氢乳清酸酶。

6.根据权利要求1所述的二氢乳清酸酶法制备天冬氨酰小肽的方法，其特征在于步3）中，所述的弱碱性条件为pH7.5~9.5。

7.根据权利要求1所述的二氢乳清酸酶法制备天冬氨酰小肽的方法，其特征在于步骤3）中，所述的酶或湿菌体与带有末端羧基的二氢乳清酸小肽类化合物的重量比为1:1~80。

8.根据权利要求1所述的二氢乳清酸酶法制备天冬氨酰小肽方法，其特征在于步骤4）中，所述的亚硝酸为亚硝酸钠与稀盐酸的混合溶液；或者在稀盐酸-底物溶液中滴加亚硝酸钠溶液。