[发明专利]一种二氢乳清酸酶法制备α-天冬氨酰小肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种二氢乳清酸酶法制备α-天冬氨酰小肽的方法。

背景技术

α-天冬氨酰小肽类化合物是指天冬氨酸的α-位羧基与其他氨基酸或小肽类化合物形成的小肽类化合物（一般不超过两个氨基酸），这些小肽类化合物及其衍生物在食品、药品领域具有重要的应用价值。如各种甜味剂：L-α-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯（阿斯巴甜）、L-α-天冬氨酞-N-(2，2，4，4-四甲基-3-硫化三亚甲基)-D-丙氨酰胺（阿力甜）、N-[N-(3,3-二甲基丁基)-L-α-天门冬氨酰]-L-苯丙氨酸甲酯（乐甜）、β-O-苄基-L-α-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯（蔗糖甜味的1000倍）、L-α-天冬氨酰-O-冰片基-L-丝氨酸甲醋等等。这些甜味剂其甜味均超过蔗糖甜味200倍以上，而且热量低、口味纯正、安全性高，主要添加于饮料、维他命含片或口香糖代替糖的使用，许多糖尿病患者、减肥人士都以阿斯巴甜做为糖的代用品。但这些甜味剂的结构中均要求N-端氨基酸必须是天冬氨酸或氨基丙二酸。

另外，N-乙酰天冬氨酰谷氨酸（NAAG）是哺乳动物脑组织内一种含量很高，且分布特异的神经二肽，具有重要生理学和药学价值。相关研究表明：N-乙酰天门冬氨酰谷氨酸可被酸性二肽酶(NAALAD)分解得到N-乙酰天门冬氨酸和L-谷氨酸。其在下丘脑中的含量低于中脑、脑桥和脊髓，主要存在于脑内某些感觉和运动系统中，在兴奋性神经传递过程中起神经递质或调质的功能。在治疗阿尔茨海默氏症、帕金森症、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿氏病、精神分裂症等疾病上有一定的药学作用，同时可以有效促进脑功能恢复，在治疗视神经炎及视神经萎缩方面也有一定的作用。

目前，α-天冬氨酰小肽类化合物的制备方法主要有化学合成法、酶法和微生物发酵法，其关键步骤在于将天冬氨酸的α-羧基与氨基酸形成肽键过程。在此过程中，化学合成法易产生天冬氨酸消旋化或β-位羧基参与合成的副反应。例如在阿斯巴甜的化学合成过程中，按天冬氨酸衍生物的种类和合成中关键中间体的不同，化学法合成又可以分为9种不同的途径：内酐法、内酯法、N-羰基酸酐法、羰基硫代酸酐法、活性酯法、混合酸酐法、直接缩合法、树脂法、L-天冬酰胺法，而较有实用价值，应用的最多的还是内酐法和内酯法。无论采用哪种合成方法，总会产生天冬氨酸消旋化或β-位羧基参与合成的副反应，其副产物是D-Asp的α-羧基或Asp的β-羧基与氨基酸形成的异构体，这些副产物很难除去。因此，对这两种异构体的处理成为各种合成法中耗时费力的步骤，有效解决这个问题是降低成本的一个关键。目前的作法是通过保护β-位羧基而提高α-位羧基的活性，如将β-位羧基保护起来，或者通过酯化活化α-位羧基，或使用不同的反应溶剂等，以使反应产物中α与β-异构体的比值尽可能提高。

酶法合成是使用合适的蛋白酶将L-Asp(氨基已保护或未保护)与氨基酸缩合在一起，或者利用天冬氨酸酶，以富马酰-氨基酸为底物，加氨或氨供体，形成最终的α-天冬氨酰小肽。例如，1979年Isowa Y．等用嗜热菌蛋白酶(Thermolysinthermoase)成功地利用L-苯丙氨酸甲酯和被护L-天冬氨酸合成a-APM前体；樊可可等采用木瓜蛋白酶在乙酸乙酯和水组成的两相溶剂中催化合成了苄氧羰基-L-天冬氨酸-α-甲酯；采用内酞酶(Endepeptidase)可催化苯甲酰基-L-天冬氨酸-a-甲酯与苯丙氨酸甲酯反应，生成苯甲酰基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯；而利用嗜热脂肪芽胞杆菌(Baci l lussteaarothermophilus)的中性蛋白酶，在pH值为6.4水溶液中将苄氧羰基-L-天冬氨酸同苯丙氨酸甲酯盐酸盐反应生成苄氧羰基-L-天冬氨酰-L-苯丙氨酸甲酯。另外，以顺丁烯二酸酐(马来酐)与L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐为原料，用化学法缩合得马来酰-L-苯丙氨酸甲酯(MPM)，并使之异构化为富马酰-L-苯丙氨酸甲酯(FPM)，然后以FPM为底物，加氨或氨供体，经菌体转化直接生成阿斯巴甜(APM)。Nakayama等人报道了用多种微生物转化FPM为APM的研究，其中以大肠杆菌ATCCl1303转化率最高(4.3g/L)，许激扬等采用自筛的E.coli CPU8901，使产物质量浓度提高至5.6g/L。樊可可等则筛选到一株假单胞菌，发现它能直接以MPM为底物，经顺反异构与加氨两步连续的酶促反应直接生成APM，而且产物质量浓度提高到6.3g/L。