[发明专利]快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法及其应用

权利要求书

1.一种快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a、将黄单胞菌8004菌种在LB固体平板上划线培养，28℃培养48小时；

b、挑取单克隆接种于10ml LB液体培养基中，置于28℃摇床上220rpm/min过夜培养；

c、等分过夜培养物到四个5ml离心管中，室温下以8000rpm/min离心5min，收集细胞；

d、用1ml的250mM蔗糖溶液重悬菌体，室温下以12000rpm/min离心2mmin，重复上述重悬-离心步骤三次，收集细胞；

e、每管细胞中加入25μl的250mM蔗糖溶液，重悬并合并四管细胞后，分装50μl/管，-80℃冻存，得到细胞终浓度为10⁹-10¹⁰℃FU/ml的黄单胞菌电转化感受态细胞。

2.根据权利要求1所述的黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、取50μl黄单胞菌电转化感受态细胞，加入相应量的质粒DNA，混匀后转入预冷的电转化杯电击；

B、电击后，迅速在电转化杯中加入1ml LB液体培养基并转移至试管中，28℃摇培1～3小时；

C、将孵育后的培养液涂布于抗性平板上，28℃培养48～72个小时后观察克隆生长情况与计算克隆数目。

3.根据权利要求2所述的黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法，其特征在于：所述黄单胞菌电转化感受态细胞的细胞浓度OD₆₀₀为0.4-1.2，所述相应量的质粒DNA的量为50ng～1μg，所述电击时的电击强度为10-20KV/cm。

4.根据权利要求2所述的黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法，其特征在于；所述黄单胞菌电转化感受态细胞的细胞浓度OD₆₀₀为0.6-1.0，所述相应量的质粒DNA的量为50ng～1μg，所述电击时的电击强度为14-18KV/cm，所述28℃摇培时间为2小时。

5.根据权利要求2所述的黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法，其特征在于；所述的质粒包括可复制质粒和不可复制质粒，可复制质粒包括pUFR027、pDN19和pRKaraRed；不可复制质粒包括pK18mobsacB-xc1075和pK18mobsacB-Xc2659；可复制质粒DNA的量为50ng～1μg，不可复制质粒DNA的量为500ng～1μg。

6.根据权利要求2所述的黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法，其特征在于：所述的抗性平板含四环素10μg/ml或卡那霉素10μg/ml。

7.根据权利要求1所述的快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法的应用，其特征在于：用于可复制质粒与不可复制质粒的高效转化；可复制质粒包括pUFR027、pDN19或pRKaraRed；不可复制质粒包括pK18mobsacB-Xc1075或pK18mobsacB-Xc2659。