[发明专利]快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法及其应用无效

专利信息
申请号: 201210379735.0 申请日: 2012-10-08
公开(公告)号: CN102876610A 公开(公告)日: 2013-01-16
发明(设计)人: 梁如冰;马辰;刘建华 申请(专利权)人: 上海交通大学
主分类号: C12N1/20 分类号: C12N1/20;C12N15/63;C12R1/64
代理公司: 上海科盛知识产权代理有限公司 31225 代理人: 杨元焱
地址: 200240 *** 国省代码: 上海;31
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摘要:
搜索关键词: 快速 制备 黄单胞菌电 转化 感受态 细胞 方法 及其 应用
【说明书】:

技术领域

发明属基因工程技术领域,涉及一种快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法,用于多种质粒的高效转化与染色体基因的敲除。

技术背景

黄单胞菌Xcc 8004是一种具有植物致病性的革兰氏阴性菌,可引起十字花科植物的“黑腐病”,会对农业生产造成极大的影响。黄单胞菌可通过植物的气孔、根系或者伤口感染十字花科植物如:卷心菜、西兰花、花菜及拟南芥等。开展对黄单胞菌质粒转化与基因改造方法的研究有利于提高其DNA转化、基因敲除及染色体修饰的效率,推进其致病机制的研究和防范策略的开发。

因黄单胞菌可分泌多种胞外酶和胞外多糖,其对化学处理十分不敏感,因此电转化方法成为外源DNA进入黄单胞菌的首选方法。但是,已报道的黄单胞菌电转化方法的质粒转化效率远远低于大肠杆菌的电转化效率,主要是黄单胞菌胞外分泌的多种蛋白和多糖的去除效率会直接影响电转化感受态细胞的敏感性,外源DNA难于进入细胞内,因而降低了电转化效率。另一方面,基因改造是开展黄单胞菌致病机制研究的必经步骤。现有的黄单胞菌基因替换方法是利用不可复制质粒,通过与特定的大肠杆菌菌株进行接合,来实现质粒整合与基因重组。这种方法操作复杂,耗时较长,且效率偏低。因此,开发新方法来提高黄单胞菌的质粒转化与基因改造效率,简化黄单胞菌基因修饰过程,具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的,是为了提高黄单胞菌的DNA转化和基因替换效率,简化操作步骤,提供一种快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法及其应用。

为了实现本发明的目的,本发明采用了以下技术方案:

一种快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法,包括如下步骤:

a、将黄单胞菌8004菌种在LB固体平板上划线培养,28℃培养48小时;

b、挑取单克隆接种于10ml LB液体培养基中,置于28℃摇床上220rpm/min过夜培养;

c、等分过夜培养物到四个5ml离心管中,室温下以8000rpm/min离心5min,收集细胞;

d、用1ml的250mM蔗糖溶液重悬菌体,室温下以12000rpm/min离心2min,重复上述重悬-离心步骤三次,收集细胞;

e、每管细胞中加入25μl的250mM蔗糖溶液,重悬并合并四管细胞后,分装50μl/管,-80℃冻存,得到细胞终浓度为109-1010CFU/ml的黄单胞菌电转化感受态细胞。

上述黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法,包括以下步骤:

A、取50μl黄单胞菌电转化感受态细胞,加入相应量的质粒DNA,混匀后转入预冷的电转化杯电击;

B、电击后,迅速在电转化杯中加入1ml LB液体培养基并转移至试管中,28℃摇培1~3小时;

C、将孵育后的培养液涂布于抗性平板上,28℃培养48~72个小时后观察克隆生长情况与计算克隆数目。

上述黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法,其中,所述黄单胞菌电转化感受态细胞的细胞浓度OD600为0.4-1.2,所述相应量的质粒DNA的量为50ng~1μg,所述电击时的电击强度为10-20KV/cm。

经检测,上述黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法的最佳条件是,黄单胞菌电转化感受态细胞的细胞浓度OD600为0.6-1.0,质粒DNA的量为50ng~1μg,电击时的电击强度为14-18KV/cm,28℃摇培时间为2小时。

上述黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法,其中,所述的质粒包括可复制质粒和不可复制质粒,可复制质粒包括pUFR027、pDN19和pRKaraRed;不可复制质粒包括pK18mobsacB-Xc1075和pK18mobsacB-Xc2659;可复制质粒DNA的量为50ng~1μg,不可复制质粒DNA的量为500ng~1μg。

上述黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法,其中,所述的抗性平板含四环素10μg/ml或卡那霉素10μg/ml。

上述快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法用于可复制质粒与不可复制质粒的高效转化;可复制质粒包括pUFR027、pDN19或pRKaraRed;不可复制质粒包括pK18mobsacB-Xc1075或pK18mobsacB-Xc2659。

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