[发明专利]超高压提取金银花中绿原酸和木犀草苷及液相分析方法

说明书

技术领域

本发明生物技术领域，具体的涉及一种快速、高效提取金银花中绿原酸和木犀草苷并进行HPLC定量分析方法。

背景技术

金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb. )的干燥花蕾或带初开的花,具有清热解毒、抗菌消炎、保肝利胆的功能、凉热散风、抗病毒和增强免疫力的功效,是常用中药材之一。绿原酸和木犀草苷是金银花药材中代表性的药效成分，并且2010版《中国药典》已经增加了对木犀草苷含量检测项目。 金银花中绿原酸和木犀草苷的提取方法主要有水煎煮法、有机溶剂回流提取法、超声提取法、微波提取法、超临界CO2萃取等。水煎煮法和有机溶剂回流提取法在较高温度下进行,容易导致活性有效成分的损失,分解、变化，产物中杂质含量高，提取时间长，工艺繁琐等。而微波提取和超声提取虽然提取时间、能耗等大大降低，但存在噪音大、难以规模化生产等不足。超临界CO2萃取法存在设备投资大，耗费高，对相对分子质量高、极性强的物质提取困难等问题。此外，2010版《中国药典》分别采用不同的HPLC分析方法对绿原酸和木犀草苷的含量进行测定，测定时间长，不利于快速分析和大批量样品质量控制的需要。因此，开发一种快速、高效提取金银花中绿原酸和木犀草苷并同时对该两种成分进行HPLC定量分析的方法,对金银花药材及相关产品的质量控制具有较高的应用价值。

目前已有超高压技术提取金银花的报道，但运用超高压提取技术来提取金银花中绿原酸和木犀草苷并建立一种HPLC方法来同时测定这两种成分的方法还未见报道。

发明内容

为克服现有技术中的不足，本发明提供一种快速、高效提取金银花中绿原酸和木犀草苷并进行HPLC定量分析方法。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种快速、高效提取金银花中绿原酸和木犀草苷并进行HPLC定量分析方法，包括如下步骤：

1）超高压提取：首先将干燥的的金银花粉碎过60-80目筛，再将金银花粉末按1:10-1:100的固液比加入水或乙醇（浓度为10%-90%）、甲醇、正丁醇有机溶剂，混合密封后在常温下浸泡0 -24 h，再将该混合物置于高压容器中，在20-60℃下施加100-500MPa压力进行浸取，其保压时间为1-5min，卸压后将提取物进行离心分离，得金银花提取液。

2）定量分析：取离心后得到的上清液2ml于10ml的容量瓶中，用蒸馏水定容，冷藏备用；HPLC条件为：Cosmosil π-NAP C₁₈ 色谱柱(5 μm, 4.6 mm × 250 mm)；流动相：A：B = 乙腈：0.4%磷酸溶液；梯度洗脱条件：0～15min，B：90-80%，15～30min，B：80%，30～40min，B: 80-70%；柱温：30℃；流速：1ml/min；检测波长：327nm，350nm；进样量：20μL。 

进一步的，所述步骤（1）中的超高压提取(ultrahigh-pressure extraction,UHPE), 全称为“冷等静压技术”，是指在常温下用100-1000MPa的流体静压力作用于提取溶剂和中药的混合液上, 并在预定压力下保持一段时间, 使植物细胞内外压力达到平衡后迅速卸压。由于细胞内外渗透压力忽然增大, 细胞膜的结构发生变化, 使得细胞内的有效成分能够穿过细胞的各种膜而转移到细胞外的提取液中, 达到提取中药有效成分的目的。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

（1）目前传统的提取方法需要加热，容易造成金银花中有效成分的破坏、变性。本方法在40℃下进行，避免了因热效应引起的有效成分结构变化损失以及生理活性的降低。而且，已有研究报道，生物材料受高压作用时，只有大分子物质发生变性，而小分子物质不会受影响。因此，超高压提取时不会发生绿原酸和木犀草苷的破换、变性。

（2）应用超高压技术提取绿原酸和木犀草苷可以大大缩短提取时间，仅为4 min，是回流提取的2%，能量消耗低，同时超高压提取是在一个密闭的环境中进行的，没有溶剂的挥发，因此该技术更加符合绿色环保的要求。

（3）跟传统方法相比，超高压提取的效率高，而且提取液中的杂质含量低，有利于活性物质的分离和纯化。

（4）新建立的HPLC分析方法能同时对绿原酸和木犀草苷进行分析，简单、准确、快速、紧密度高、重复性好，对金银花药材及相关产品的质量控制具有较高的应用价值。