[发明专利]一种高特异高敏感检测食源性致病性耶尔森氏菌的方法

说明书

技术领域

 本发明涉及疾病检测技术领域，具体的说，是一种高特异高敏感检测食源性致病性耶尔森氏菌的方法。

背景技术

耶尔森氏菌为动物肠道寄生菌，广泛存在于动物体内。本菌在外界环境(河水、井水、蒸馏水)中不仅可长期生存，而且可以繁殖。本菌有嗜冷性，食品一旦被污染，在冷藏中仍能继续繁殖，故该病冬季多发。现代文明的“电冰箱肠炎”致病菌，就是人兽共同的耶尔森氏菌。 耶尔森氏菌属包括11种，其中对人有致病性的有三种：小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核菌和鼠疫菌。只有小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核菌已确定是食源性病原体。快速检测食源性致病性耶尔森氏菌对于食品卫生具有很大的意义。

环介导等温扩增技术是由日本荣研（EIKEN）株式会社开发的高特异性敏感度的核酸检测系统，无须昂贵的设备，已经成为核酸快速检测法的良好手段，本发明结合环介导等温扩增技术，设计针对耶尔森氏菌特异性基因序列的一对外引物（Y-F3和Y-B3）和一对内引物（Y-FIP和Y-BIP）进行环介导等温扩增。

发明内容

本发明公开了一种高特异高敏感检测食源性致病性耶尔森氏菌的方法，提高了食源性致病性耶尔森氏菌的检测和诊断效率。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种高特异高敏感检测食源性致病性耶尔森氏菌的方法，包括以下步骤：

步骤1）制备反应液

反应液组成及含量为

8u/ul Bst核酸聚合酶                          8u

10X耐热聚合酶反应缓冲液                 1X，MgSO4 2mM

4M 甜菜碱                                    1M

10mM d-NTP混合液                            400μM

内引物

   Y-FIP                                   40umol

   Y-BIP                                   40umol

外引物

   Y-F3                                    5umol

   Y-B3                                    5umol

标本核酸                                   20ng

添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul;

步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;

步骤3）提取临床分离空肠耶尔森氏菌，大肠耶尔森氏菌，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。

进一步的，所述外引物Y-F3的序列为TCTCACACACTAAAAACTGC。

进一步的，所述外引物Y-B3的序列为ACCATATGGCTGGAACAAG。  

进一步的，所述内引物Y-FIP的序列为

TTGATTCGATTCACGGATTGCTTT-AAATAGCTATACCGATGTGACT。

进一步的，所述内引物Y-BIP的序列为ATTCCGTCAACTTGACAACCG-TGAACTGGCTAAACCTTTGT。

进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。

进一步的，所述食源性致病性耶尔森氏菌包括空肠耶尔森氏菌和大肠耶尔森氏菌。

本发明的有益效果是：

    本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测食源性致病性耶尔森氏菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。

具体实施方式

下面将结合实施例，来详细说明本发明。

 一种高特异高敏感检测食源性致病性耶尔森氏菌的方法，包括以下步骤：

步骤1）制备反应液

反应液组成及含量为

8u/ul Bst核酸聚合酶                          8u

10X耐热聚合酶反应缓冲液                 1X，MgSO4 2mM