[发明专利]一种高特异高敏感检测肠聚集性大肠杆菌的方法

权利要求书

1.一种高特异高敏感检测肠聚集性大肠杆菌的方法,其特征在于，包括以下步骤：

步骤1）制备反应液

反应液组成及含量为

8u/ul Bst核酸聚合酶                            8u

10X耐热聚合酶反应缓冲液                 1X，MgSO4 2mM

4M 甜菜碱                                    1M

10mM d-NTP混合液                             400μM

内引物

   EAEC-FIP                                   40umol

   EAEC-BIP                                   40umol

外引物

   EAEC-F3                                    5umol

   EAEC-B3                                    5umol

标本核酸                                      20ng

添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul；

步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;

步骤3）提取临床分离肠聚集性大肠杆菌，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。

2.  根据权利要求1所述的高特异高敏感检测肠聚集性大肠杆菌的方法，其特征在于：所述外引物EAEC-F3的序列为CATATGGTGCACAACAGC。

3.根据权利要求2所述的高特异高敏感检测肠聚集性大肠杆菌的方法，其特征在于：所述外引物EAEC-B3的序列为GTAGGTAGGTAGGTAGGTAAC。

4.根据权利要求3所述的高特异高敏感检测肠聚集性大肠杆菌的方法，其特征在于：所述内引物EAEC-FIP的序列为

CCGAAACTGGCTTAAAGGTCTAAAA-GGACTACAAAGCCGTCAC。

5.根据权利要求4所述的高特异高敏感检测肠聚集性大肠杆菌的方法，其特征在于：所述内引物EAEC-BIP的序列为CCAGTCGGCTAATTCTTTCATATCA-TCTCATTGAATTGTTTAACGCT。

6.根据权利要求5所述的高特异高敏感检测肠聚集性大肠杆菌的方法，其特征在于：所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。