[发明专利]一种高特异高敏感检测肠聚集性大肠杆菌的方法

说明书

技术领域

 本发明涉及疾病检测技术领域，具体的说，是一种高特异高敏感检测肠聚集性大肠杆菌的方法。

背景技术

肠聚集性大肠杆菌（EAEC）是导致腹泻的病原菌，在发展中国家儿童中常引起水样腹泻。最近，有学者认为肠聚集性大肠杆菌是引起旅行者腹泻的最主要原因。感染肠聚集性大肠杆菌后，最典型的症状是黏性水样便，同时伴有发热、恶心、呕吐等症状，快速检测肠聚集性大肠杆菌，对预防食物中毒以及确定有效治疗方案具有很大意义。

环介导等温扩增技术是由日本荣研（EIKEN）株式会社开发的高特异性敏感度的核酸检测系统，无须昂贵的设备，已经成为核酸快速检测法的良好手段，本发明结合环介导等温扩增技术，设计针对肠聚集性大肠杆菌（EAEC）特异性基因序列的一对外引物（EAEC -F3和EAEC -B3）和一对内引物（EAEC -FIP和EAEC -BIP）进行环介导等温扩增。

发明内容

本发明公开了一种高特异高敏感检测肠聚集性大肠杆菌的方法，提高了它的检测和诊断效率。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种高特异高敏感检测肠聚集性大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

步骤1）制备反应液

反应液组成及含量为

8u/ul Bst核酸聚合酶                            8u

10X耐热聚合酶反应缓冲液                 1X，MgSO4 2mM

4M 甜菜碱                                    1M

10mM d-NTP混合液                             400μM

内引物

   EAEC-FIP                                   40umol

   EAEC-BIP                                   40umol

外引物

   EAEC-F3                                    5umol

   EAEC-B3                                    5umol

标本核酸                                      20ng

添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul；

步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;

步骤3）提取临床分离肠聚集性大肠杆菌，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。

进一步的，所述外引物EAEC-F3的序列为CATATGGTGCACAACAGC。

进一步的，所述外引物EAEC-B3的序列为GTAGGTAGGTAGGTAGGTAAC。  

进一步的，所述内引物EAEC-FIP的序列为

CCGAAACTGGCTTAAAGGTCTAAAA-GGACTACAAAGCCGTCAC。

进一步的，所述内引物EAEC-BIP的序列为CCAGTCGGCTAATTCTTTCATATCA-TCTCATTGAATTGTTTAACGCT。

进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。

本发明的有益效果是：

    本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测肠产毒性大肠杆菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。

具体实施方式

下面将结合实施例，来详细说明本发明。

 一种高特异高敏感检测肠聚集性大肠杆菌的方法，包括以下步骤：

步骤1）制备反应液

反应液组成及含量为

8u/ul Bst核酸聚合酶                            8u

10X耐热聚合酶反应缓冲液                 1X，MgSO4 2mM

4M 甜菜碱                                    1M

10mM d-NTP混合液                             400μM