[发明专利]用于检测冬生疫霉的引物对和探针及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种用于检测冬生疫霉的引物对和探针及其检测方法。

背景技术

冬生疫霉（Phytophthora hibernalis Carne）是导致柑橘褐腐疫病的主要病原菌之一，柑橘褐腐疫病在果实采收前、采收后发生均可造成重大的经济损失，尤其是在雨季。该病菌在澳大利亚西部的柑橘果实上首次被发现，随后在欧洲、美洲及非洲等许多国家均有报道。该病菌主要侵染柑橘属植物的果实和枝叶，还可侵染杜鹃、玫瑰、红花、芝麻、番茄、苹果等多种植物，导致植物出现枯萎、根腐或溃疡症状。

因此开发冬生疫霉的早期快速检测技术，对相关植物生产中的病害防控和无公害化具有重要的意义。

近年来，实时荧光定量PCR（荧光RT-PCR）技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌消长动态的分子检测与预警，然而国内外鲜有利用荧光RT-PCR技术检测冬生疫霉方面的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测冬生疫霉的引物对和探针。

本发明的另一目的是提供用于检测冬生疫霉的荧光RT-PCR法。

为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测冬生疫霉的引物对，其包括上游引物PH-F：5’-CGACTTGCCACCGGGA-3’（SEQ IDNo.1）和下游引物PH-R：5’-AACGGTACTTCTCTTTGCTCGAA-3’（SEQ ID No.2）。

本发明还提供含有上述引物对PH-F和PH-R的用于检测冬生疫霉的试剂盒。

本发明还提供一种用于检测冬生疫霉的探针，所述探针为：5’-F1-TTCCACAACCAATTCCAT-Q1-3'（SEQ ID No.3），其中F1为报告荧光基团，Q1为非荧光性的淬灭基团。优选F1为FAM荧光染料，Q1为MGB。

本发明还提供一种检测冬生疫霉的荧光RT-PCR法：以样品DNA为模板，采用引物对PH-F和PH-R以及上述探针进行荧光RT-PCR反应，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。

上述荧光RT-PCR扩增反应中，25μL的反应体系含有成分如下：样品DNA 1μL(0.0005-50ng)，10×PCR反应缓冲液（不含Mg²⁺）2.5μL，25mM MgCL₂ 2.0μL，2.5mM dNTP 2.0μL，10μM引物PH-F 1μL，10μM引物PH-R 1μL，10μM探针1.5μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.3μL，ddH₂O 13.7μL。

荧光RT-PCR扩增反应过程中使用的退火温度为60℃。优选地，反应程序为：95℃3min；95℃10s，60℃30s，40个循环。

本发明还提供用于检测冬生疫霉的试剂盒，其包括引物对PH-F和PH-R以及上述探针。

优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的一种或多种。

更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明在测序分析冬生疫霉及其近似种和近缘种的ITS序列的基础上，分别设计用于检测冬生疫霉的引物对和荧光探针。该探针与普通的Taqman探针不同之处在于3'端采用了非荧光性的淬灭基因，即淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。

Taqman MGB探针技术，即将报告荧光染料标记在探针的5’端，而3'端采用了非荧光性的淬灭基因，二者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭基团吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭基团的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对冬生疫霉的检测。

本发明根据冬生疫霉ITS序列，设计出可快速检测冬生疫霉病菌的特异性引物对和探针，并在此基础上建立了荧光RT-PCR检测法，可从发病植物组织及土壤中复杂的病原菌环境快速、准确地检测出冬生疫霉。根据该方法构建的检测试剂盒操作简便，特异性好，灵敏度高，对冬生疫霉疫情的早期预警、疫区的病原监测以及进出口安全等方面具有重要意义。

附图说明