[发明专利]丙型肝炎病毒核心抗原时间分辨免疫荧光分析法及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及丙型肝炎病毒核心抗原时间分辨免疫荧光分析法及检测试剂盒，属于时间分辨免疫荧光分析法以及体外诊断检测领域。

背景技术

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)呈球形，直径小于80nm（在肝细胞中为36～40nm，在血液中为36-62nm），为单股正链RNA病毒，在核衣壳外包绕含脂质的囊膜，囊膜上有刺突。丙型肝炎病毒可引起丙型肝炎主要经输血，针刺，吸毒等传播。HCV感染通常是持续性的终生感染，抗体检测是一个非常有效的方法。但因感染HCV后,抗HCV出现较慢，一般情况下，抗体的血清学转换可以延迟到暴露后几个月才发生，此时可发生抗HCV的假阴性(也就是说在抗体可检出之前或在血清学转换之中即所谓的“窗口期”)，故在早期诊断丙肝感染上有困难。HCV核心抗原检出时间早于抗体，HCV-cAg检测可作为HCV抗体检测的补充试剂。

目前丙型肝炎的检测方法主要有三类:

1.丙型肝炎抗体检测:其缺点是感染丙型肝炎病毒HCV后，有2-26周的潜伏期，一般到抗HCV抗体出现(转阳)有一个较长的窗口期，平均为70d，有的患者窗口期可延长至6-9个月或更长。由于窗口期的存在，对潜伏期和隐形感染者容易造成漏检，机体感染HCV后，在抗HCV抗体出现之前约2周左右，血循环中即可出现病毒颗粒，此时丙型肝炎病毒HCV的RNA经PCR方法检测可为阳性，血液具有感染性，而用抗体检测方法根本无法测出；

2.丙型肝炎病毒HCV核酸检测:感染丙型肝炎病毒HCV后1-2周，血清中即可检测到HCV-RNA。因此，HCV核酸检测(HCV RT-PCR检测)可用于丙型肝炎的早期诊断，并且通过对病毒拷贝数的定量检测可对其临床疗效进行监测。因为PCR法检测HCV-RNA影响因素较多，在样本收集、储存和检测方面都有严格的要求，并且PCR的检测操作过程复杂、费时；

3.丙型肝炎抗原检测:丙型肝炎病毒HCV核心抗原是由HCV基因中最为保守的部分编码而来，在HCV-RNA出现后的1-2d内即出现丙型肝炎病毒HCV抗原，且与HCV-RNA的水平相平行，可以作为HCV复制的标志。有研究表明，HCV抗原检测与抗HCV抗体检测相比，HCV抗原的检测可使检测的窗口期平均提前49天，缩短窗口期HCV感染者的献血的风险。与RT-PCR方法相比具有操作简便、时间短、对环境要求低的特点，在临床上可用于早期急性丙型肝炎诊断。

时间分辨免疫荧光分析(Time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA)是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析法。它利用了具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，以代替传统的荧光物质、酶、同位素、化学发光物质。用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，准确地测定反应体系中被分析物的浓度。TRFIA 所使用的荧光标记物是镧系稀土金属，由于镧系稀土金属离子螯合物有很长的荧光寿命(微秒级)，有别于传统荧光的短荧光寿命，使其能通过时间分辨方式区别于背景荧光（钠秒级），正是由于荧光衰变时间长，可以延缓测量时间，待测样品中短寿命的本底荧光衰变后再测稀土离子的特异荧光，因此可完全消除本底荧光的干扰。镧系稀土金属离子螯合物荧光很宽的Stokes 位移使其容易通过波长分辨方式进一步区别于背景荧光，提高方法学的稳定性。镧系稀土金属离子螯合物狭窄的荧光发射峰使其荧光检测具有很高的效率，进一步提高了信号检测的特异性和灵敏性。此外，由于检测时加入了荧光增强液，它可使原来荧光增强100万倍，以上各种因素使TRFIA 的检测灵敏度和准确性大大提高。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于丙型肝炎病毒核心抗原检测的时间分辨免疫荧光分析法及检测试剂盒，主要解决现有技术存在的灵敏度低、稳定性差、操作烦琐及污染环境等技术问题。最主要解决的问题是缩短窗口期，可用于早期急性丙型肝炎诊断。

本发明采用时间分辨免疫荧光分析法，检测丙型肝炎病毒核心抗原。该检测建立双抗体夹心的基础之上，在这里，样品中的核心抗原首先被包被于微孔板上的抗HCV-cAg单克隆抗体I、II固相抗体捕获。在洗掉样品的其它部分，再加入抗HCV-cAg单克隆抗体III、IV铕标记抗体，就可以形成抗HCV-cAg单克隆抗体固相抗体-核心抗原-抗HCV-cAg单克隆抗体铕标记抗体复合物，洗板加入增强液，用时间分辨分析仪测量荧光值，荧光值与样本中核心抗原浓度呈正相关，从而计算核心抗原浓度。