[发明专利]肺炎链球菌多重降落PCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种肺炎链球菌多重降落PCR检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，MgCl₂，dNTP，Taq DNA聚合酶，BSA，肺炎链球菌阳性对照DNA，3对肺炎链球菌引物；所述3对肺炎链球引物为：

SP_recA-F：5’- CAAGCGGAACTTCTTCATTCAC -3’

SP_recA-R：5’-CAGACTCAGGAGAGCAAGGT -3’

SP_ply-F：5’- GCCTCTATCCTGGAGCACTT -3’

SP_ply-R：5’- AGCAGCCTCTACTTCATCACT-3’

SP_16S rRNA-F：5’- CTGTGGCTTAACCATAGTAG -3’

SP_16S rRNA-R：5’- CTAGCACTCATCGTTTACA -3’。

2.一种肺炎链球菌多重降落PCR检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)提取待检样本DNA

(2)多重PCR法扩增检测待检样本DNA中的recA、ply、16S rRNA基因，具体步骤如下：

反应体系：25 μl，包括H₂O 9.05 μl，缓冲液（10×PCR）2.5 μl， BSA(10 mg/ml) 0.25 μl，SP_recA-F（10 μmol/L）3 μl，SP_recA-R（10 μ mol/L）3μl，SP_ply-F（10 μmol/L） 0.25 μl，SP_ply-R：（10 μmol/L）0.25 μl，SP _16S rRNA-F（10 μmol/L）0.5 μl，SP _16S rRNA-R（10 μmol/L） 0.5 μl，MgCl₂(25 mM)3 μl，dNTP(10 mM) 0.5 μl，Taq DNA聚合酶（5 U/μl）0.2 μl，DNA 模板 2 μl

3对肺炎链球引物为：

  SP_recA-F：5’- CAAGCGGAACTTCTTCATTCAC -3’

  SP_recA-R：5’-CAGACTCAGGAGAGCAAGGT -3’

  SP_ply-F：5’- GCCTCTATCCTGGAGCACTT -3’

  SP_ply-R：5’- AGCAGCCTCTACTTCATCACT-3’

  SP_16S rRNA-F：5’- CTGTGGCTTAACCATAGTAG -3’

  SP_16S rRNA-R：5’- CTAGCACTCATCGTTTACA -3’

(3)PCR反应循环参数如下：

94 ℃ 5min；94 ℃ 30s, 65 ℃ (每循环降低0.5 ℃) 30 s, 72 ℃ 1 min，20个循环；94 ℃ 30s, 55 ℃ 30s, 72 ℃ 1 min, 20 个循环；72 ℃ 7 min

(4)电泳检测鉴定：

对多重降落PCR反应产物进行琼脂糖电泳检测，如电泳图中含有217 bp、581 bp、735 bp条带中的2条或3条则代表检出肺炎链球菌。