[发明专利]肺炎链球菌多重降落PCR检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及肺炎链球菌感染的分子诊断技术领域，具体涉及多重降落PCR 检测方法在下呼吸道标本中肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）检测中的应用。

背景技术

   肺炎链球菌又名肺炎球菌，是社区获得性肺炎（CAP）的主要病原体，培养要求较高。易发生肺炎链球菌肺部感染的高危人群有：免疫缺陷者、呼吸道病毒感染后、婴幼儿、年老体弱者。肺炎链球菌是慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者发生CAP的主要病因，此外肺炎链球菌还可引起脑膜炎、中耳炎及脓毒血症等疾病。

Corless, C.E等（Corless, C.E., et al., Simultaneous detection of Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, and Streptococcus pneumoniae in suspected cases of meningitis and septicemia using real-time PCR. J Clin Microbiol, 2001. 39(4): p. 1553-8.）建立了以ply基因为靶标检测肺炎链球菌的实时PCR，支持ply基因为肺炎链球菌所固有。Murdoch, D.R报道了以ply基因为靶标建立的PCR可将部分甲型溶血性链球菌误鉴定为肺炎链球菌（Murdoch, D.R., Molecular genetic methods in the diagnosis of lower respiratory tract infections. APMIS, 2004. 112(11-12): p. 713-27.）同时针对肺炎链球菌的多个基因进行检测可提高检测方法的特异性。Korbie, D.J.等（Korbie, D.J. and J.S. Mattick, Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification. Nat. Protocols, 2008. 3(9): p. 1452-1456.）发现降落PCR可提高PCR的特异性与灵敏度。当前尚无同时针对肺炎链球菌recA、ply、16S rRNA基因以检测肺炎链球菌的多重PCR报道。本发明建立的多重降落PCR可直接检测下呼吸道标本中的肺炎链球菌，费时少，具高度特异性与灵敏性，有利于肺炎链球菌感染的快速诊断与流行病学调查。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可快速特异检测下呼吸道标本中肺炎链球菌的多重PCR检测试剂盒及检测方法。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术发案实现的：

一种肺炎链球菌多重降落PCR检测试剂盒，包括：10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTP，Taq DNA聚合酶，BSA，肺炎链球菌阳性对照DNA，3对肺炎链球菌引物；

所述3对肺炎链球菌引物对序列如下：

第1对：

SP_recA-F：5’- CAAGCGGAACTTCTTCATTCAC -3’（SEQ ID NO.1）

SP_recA-R：5’- CAGACTCAGGAGAGCAAGGT -3’（SEQ ID NO.2）；

第2对：

SP_ply-F：5’- GCCTCTATCCTGGAGCACTT -3’（SEQ ID NO.3）

SP_ply-R：5’- AGCAGCCTCTACTTCATCACT -3’（SEQ ID NO.4）；

第3对：

SP_16S rRNA-F ：5’- CTGTGGCTTAACCATAGTAG -3’（SEQ ID NO.5）

SP_16S rRNA-F: 5’- CTAGCACTCATCGTTTACA -3’（SEQ ID NO.6）。

本发明还公开了应用上述试剂盒的检测方法：

（一）    提取待检样本DNA

（二）    多重降落PCR法扩增检测待检样本DNA中的recA、ply、16S rRNA基因，具体步骤如下：