[发明专利]一种重组苦豆子凝集素的制备及用途

权利要求书

1.一种源于药用植物苦豆子的凝集素，其国际基因库登录号是DQ011517.1的重组苦豆子凝集素在制备用于抗菌、抗病毒感染和抗肿瘤药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的一种重组苦豆子凝集素，其特征在于，对兔血、鼠血、人类ABO血型均有凝集作用，在pH6-10范围内和温度为30-80℃范围内，其对兔血的凝集活性稳定，D-半乳糖是与该蛋白特异性结合的糖。该重组蛋白是一种Mn²⁺依赖性蛋白。

3.根据权利要求1-2项所述的重组苦豆子凝集素的获得方法和应用，包括如下步骤：

(1)苦豆子总RNA的提取和反转录合成cDNA：将苦豆子叶片放在液氮中研磨，使用Trizol试剂提取总RNA；用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测其总RNA质量，A260/280约2.0为纯度较好；以总RNA为模板，Oligo dT为引物，使用反转录酶M-MLV(RNase H-)，合成cDNA；

(2)利用PCR扩增苦豆子凝集素基因：根据登录在国际基因库上的苦豆子凝集素基因的cDNA序列[DQ011517.1]，利用DNAMAN软件设计并合成一对引物，以步骤(1)合成的cDNA为模板，经聚合酶链式反应(PCR)扩增获得苦豆子凝集素基因的开放阅读框是843bp，回收PCR产物并纯化后，克隆到pCR2.1载体上，对阳性转化子进行菌落PCR检测，酶切鉴定重组质粒插入片段的大小正确后，进行测序分析，鉴定获得了正确的苦豆子凝集素基因；

(3)构建重组原核表达质粒pET30a-SAL及相应的重组基因工程菌：设计特异性引物用于扩增苦豆子凝集素成熟蛋白部分基因，将回收的成熟蛋白部分PCR产物SAL基因与pET30a表达载体分别进行双酶切，对双酶切的SAL和pET30a进行过夜连接，获得原核重组表达质粒pET30a-SAL；转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得基因工程菌，简称E.coliBL21/pET30a-SAL；

(4)重组质粒pET30a-SAL的高效表达及重组苦豆子凝集素的获得：以LB为基础培养基，将基因工程菌E.coli BL21/pET-30a-SAL经过IPTG诱导培养获得可溶性的重组表达蛋白，其中培养温度是28℃，IPTG的浓度为0.3mmol/L；离心收集菌体，采用超声波破碎法裂解细胞，离心获得上清可溶性蛋白，通过Ni Sepharose6Fast Flow纯化柱进行纯化，获得重组苦豆子凝集素，经SDS-PAGE电泳检测证明得到了可溶性、高效表达的重组苦豆子凝集素(His-SAL)融合蛋白；

(5)重组苦豆子凝集素的功能活性和应用

上述步骤(4)得到的纯化的重组苦豆子凝集素His-SAL具有凝血、抗真菌、抑制肿瘤活性及抑制HIV-1反转录酶活性，在制备抗农业病原真菌的生物制剂及在肿瘤和抗病毒的蛋白药物治疗方面具有良好的应用前景。

4.权利要求1～2项所述的重组苦豆子凝集素，其特征是：所述重组蛋白具有血液凝集活性，在制备新型止血药物中的用途。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征是：所述重组蛋白对兔血细胞，鼠血细胞，人类ABO血型都有凝集作用。

6.权利要求1-2项所述的重组苦豆子凝集素，其特征是：所述重组蛋白具有抑菌作用，在制备治疗病原微生物感染的抗菌药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征是：所述真菌是意大利青霉菌(Penicilliumitalicum)、指状青霉菌(Penicillium digitatum)、稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、交格链孢菌(Alternaria alternate)、毛根霉(Rhizopuses)和灰霉(Botrytis cinerea)等6种病原真菌。

8.权利要求1～2项所述的重组苦豆子凝集素，其特征是：所述重组蛋白具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，在制备治疗肿瘤药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征是：所述的肿瘤为宫颈癌和食管癌。

10.权利要求1～2项所述的重组苦豆子凝集素，其特征是：所述重组蛋白能够有效的抑制HIV-I反转录酶活性，在制备抗HIV病毒制剂中的用途。