[发明专利]一种重组苦豆子凝集素的制备及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及到一种重组苦豆子凝集素和制备方法及其所述重组苦豆子凝集素在抑菌、抗肿瘤和抗病毒方面的应用。

背景技术

凝集素(lectin)是一类结构各异的，至少有一个非催化结构域，能非共价地、可逆地结合专一性单糖或寡糖的非免疫源性、非酶本质的糖结合蛋白。他们在自然界广泛存在，在植物，动物和微生物中都发现有凝集素的存在。

目前已发现的植物凝集素有近1000种，广泛分布于豆科、石蒜科、百合科、禾本科、大戟科和茄科等众多植物中，这之中豆科植物凝集素含量最丰富。豆科凝集素具有多种生物学功能，许多研究表明豆科凝集素能干扰真菌细胞壁的产生，影响真菌正常的细胞代谢；抵御病原体入侵植物；抑制分生孢子萌发。在农业方面，转入豆科凝集素基因的农作物，抗虫、抗菌能力增强。医学方面，豆科凝集素能抑制肿瘤细胞增殖。除此之外，还具有识别糖蛋白、糖肽和生物膜中碳水化合物决定簇，作为植物的储存蛋白和微生物的共生介质等功能。随着人们对豆科凝集素结构与功能等多方面的深入研究，它在生物学、农学和医学领域的应用受到了广泛的关注。

苦豆子(Sophora alopecuroides L.)，属于豆科槐属，是我国荒漠草原及农田上一种多年生药用草本植物。主要分布于新疆、内蒙古、甘肃和宁夏等地区。苦豆子味苦性寒，具有清热解毒、祛风燥湿、止痛和杀虫等作用，并发现其具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节等药理活性。本发明利用生物工程技术，将苦豆子凝集素基因克隆到表达载体上，转化到基因工程菌中，通过发酵并应用亲和层析技术进行纯化，获得重组的苦豆子凝集素，该重组苦豆子凝集素对真菌和肿瘤细胞具有强烈的抑杀作用，而且能显著抑制HIV-1反转录酶的活性。关于苦豆子凝集素的功能与应用未见文献报道。本发明为科学认识苦豆子凝集素的功能提供依据，在抗菌制剂和抗癌蛋白药物的筛选方面具有重要的理论和应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供重组苦豆子凝集素及其制备方法，并且公开苦豆子凝集素在制备抗真菌感染、抗肿瘤和抗病毒药物中的用途。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种源于药用植物苦豆子的凝集素SAL，其国际基因库登录号是DQ011517.1的重组苦豆子凝集素的制备方法和在制备用于抗微生物感染和抗肿瘤药物中的用途，制备方法包括有苦豆子总RNA的提取和反转录合成cDNA，苦豆子凝集素基因的提取，利用PCR扩增苦豆子凝集素基因，构建原核表达载体及相应的重组基因工程菌，重组质粒pET30a-SAL的高效表达及重组苦豆子凝集素的获得。

本发明的目的还可以通过以下技术解决措施来进一步实现：一种源于药用植物苦豆子的凝集素SAL，其国际基因库登录号是DQ011517.1的重组苦豆子凝集素His-SAL在制备用于抗意大利青霉菌(Penicillium italicum)、指状青霉菌(Penicillium digitatum)、稻瘟病菌(Pyricularia grisea)、交格链孢菌(Alternaria alternate)、毛根霉(Rhizopuses)和灰霉(Botrytiscinerea)感染的用途。此外，一种源于药用植物苦豆子的凝集素SAL，其国际基因库登录号是DQ011517.1的重组苦豆子凝集素His-SAL在用于制备治疗人宫颈癌和食管癌及治疗HIV病毒所致疾病的药物中的用途。

重组苦豆子凝集素的制备方法和应用，包括以下步骤：

(1)苦豆子总RNA的提取和反转录合成cDNA：将苦豆子叶片放在液氮中研磨，使用Trizol试剂提取总RNA；用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测其总RNA质量，A260/280约2.0为纯度较好；以总RNA为模板，Oligo dT为引物，使用反转录酶M-MLV(RNase H-)，合成cDNA；

(2)利用PCR扩增苦豆子凝集素基因：根据登录在国际基因库上的苦豆子凝集素基因的cDNA序列[DQ011517.1]，利用DNAMAN软件设计并合成一对引物，以步骤(1)合成的cDNA为模板，经聚合酶链式反应(PCR)扩增获得苦豆子凝集素基因的开放阅读框是843bp，回收PCR产物并纯化后，克隆到pCR2.1载体上，对阳性转化子进行菌落PCR检测，酶切鉴定重组质粒插入片段的大小正确后，进行测序分析，鉴定获得了正确的苦豆子凝集素基因；