[发明专利]具有组成型启动子活性的DNA及其应用和巴斯德毕赤酵母表达载体

权利要求书

1.一种具有组成型启动子活性的DNA，其碱基序列如SEQ No.1所示。

2.权利要求1所述DNA在构建巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)表达载体中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将所述DNA及其下游连接结构基因或调节基因构成的表达盒整合到毕赤酵母的基因组中。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述巴斯德毕赤酵母表达载体的构建包括如下步骤：

(1)pPICZαA质粒中不含启动子5’AOX1片段的获得

引物：ZαA-F和ZαA-R，序列分别如SEQ NO.9、SEQ NO.10所示

模板：pPICZαA质粒

DNA聚合酶：PrimeSTAR HS

通过PCR方法扩增pPICZαA质粒中不含启动子5’AOX1的部分，记为DNA片段ZαA；反应条件：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸3min，循环30次；

(2)DNA片段的连接

a.酶切纯化处理：

用Bgl II，Pst I在37℃对DNA片段GCW14处理3h，并纯化酶切产物；

用Bgl II，Pst I在37℃对DNA片段ZαA处理3h，并纯化酶切产物；

b.连接：

将碱基序列如SEQ No.1所示的DNA和上述处理后的DNA片段ZαA，在T4DNA连接酶的作用下进行连接；

(3)用氯化钙进行转化

取步骤(2)所得连接产物加入到大肠杆菌Top10感受态细胞中，用移液器吹打混匀，直接涂布伯莱霉素抗性LB平板，培养16～18h；

(4)提取转化子质粒，即得到巴斯德毕赤酵母表达载体。

5.一种根据权利要求2或3或4所述应用构建的巴斯德毕赤酵母表达载体。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，该表达载体由碱基序列如SEQ No.1所示所述的DNA、α信号肽、多克隆酶切位点区、c-myc抗原表位、6×His标签、AOX1转录终止区、伯莱霉素抗性基因表达盒和PUC复制区依次连接构成。