[发明专利]具有组成型启动子活性的DNA及其应用和巴斯德毕赤酵母表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及DNA序列，具体涉及包含启动子的DNA序列及其应用，以及构建得到的巴斯德毕赤酵母表达载体。

背景技术

基因表达包括转录和翻译两个阶段。转录是指拷贝出一条与DNA链序列完全相同（除了T换成U之外）的RNA单链的过程，是基因表达的核心步骤。转录的基本过程包括模板识别、转录起始、通过启动子及转录的延伸和终止，这一个过程的关键是RNA聚合酶与启动子的相互作用。启动子是一段位于结构基因5’端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。启动子的结构影响了它与RNA聚合酶的亲和力，从而影响了基因表达的水平。

巴斯德毕赤酵母表达系统是一种常用的真核蛋白高效表达系统。典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体的启动子为醇氧化酶1（AOX1）基因的启动子，如pPICZα系列、pPIC9K等。当载有外源蛋白的重组载体转化受体后，外源基因整合到受体的染色体中，并在AOX1启动子控制下表达。AOX1启动子是诱导型启动子，其诱导物为甲醇。以P_AOX1为启动子的巴斯德毕赤酵母表达系统，P_AOX1在甲醇的诱导下起始外源基因的转录，从而实现外源蛋白的高效表达。这种表达系统在发酵过程需要用到易燃易爆且有毒的甲醇，存在一定的危险性，同时也限制了毕赤酵母表达系统在食用级蛋白生产中的应用。近年来，一些毕赤酵母内源的组成型强启动子被陆续发现，比较著名的有GAPDH基因的启动子和TEF1基因的启动子，利用这些启动子开发的毕赤酵母表达系统不需要甲醇的诱导即可表达外源蛋白，但与AOX1启动子的表达系统相比，它们表达外源蛋白的能力仍有相当的差距，因此至今仍未得到广泛的应用。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种具有组成型启动子活性的DNA。

本发明的目的之二是提供上述DNA在构建巴斯德毕赤酵母表达载体中的应用。

本发明的目的之三是提供制得的巴斯德毕赤酵母表达载体。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种具有组成型启动子活性的DNA，其碱基序列如Seq No.1所示。

本发明所述的DNA片段共822个碱基，来源于巴斯德毕赤酵母（Pichia Pastoris），位于chr1-4_0586基因（Genebank Accession No.XM_002490678）的5’端上游区，包括启动子区和5’端非翻译区，其中5’端非翻译区长度为45个核苷酸。按国际惯例，将转录起始位点规定为+1位（即本发明所述DNA片段的第778个核苷酸），转录起始位点-42bp和-101bp处存在类TATA框结构（注：TATA框是大多数酵母基因转录所必须的元件，一般位于-40~-120bp处）。

本发明所述DNA可用于构建巴斯德毕赤酵母表达载体，即组成型表达外源蛋白的重组毕赤酵母。

本发明所述DNA可用于构建组成型表达外源蛋白的重组毕赤酵母的方法是，将由所述DNA及其下游连接结构基因或调节基因构成的表达盒整合到毕赤酵母的基因组中，具体步骤如下：

（1）pPICZαA质粒中不含启动子5’AOX1片段的获得

引物：ZαA-F（SEQ NO.9）和ZαA-R（SEQ NO.10）

模板：pPICZαA质粒

DNA聚合酶：PrimeSTAR HS

通过PCR方法扩增pPICZαA质粒中不含启动子5’AOX1的部分，记为DNA片段ZαA；反应条件：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸3min，循环30次；

（2）DNA片段的连接

a．酶切纯化处理：

用Bgl II，Pst I在37℃对DNA片段GCW14处理3h，并纯化酶切产物；

用Bgl II，Pst I在37℃对DNA片段ZαA处理3h，并纯化酶切产物；

b．连接：

将碱基序列如SEQ No.1所示的DNA和上述处理后的DNA片段ZαA，在T4DNA连接酶的作用下进行连接；

（3）用氯化钙进行转化

取步骤（2）所得连接产物加入到大肠杆菌Top10感受态细胞中，用移液器吹打混匀，直接涂布伯莱霉素抗性LB平板，培养16~18h；

（4）提取转化子质粒，即得到巴斯德毕赤酵母表达载体。该表达载体由碱基序列如SEQ No.1所示所述的DNA、α信号肽、多克隆酶切位点区、c-myc抗原表位、6×His标签、AOX1转录终止区、伯莱霉素抗性基因表达盒和PUC复制区依次连接构成。