[发明专利]猪传染性胃肠炎TGE 的RT-LAMP检测方法

权利要求书

1.猪传染性胃肠炎TGE 的RT-LAMP检测方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

1）根据GenBank中TGEV N基因的保守区域，用在线软件设计LAMP引物如下： 

 FIP  5’GGCATCTGCATGAGGTCCAGACGTAAAGAGCTTCCTGAA3’

BIP 5’CAAGGATGGTGCCATGAACAAAGCTTTGGATTCATTATTAGCAC3’

F3    5’GCTATCGCATGGTGAAGG3’

B3    5’CAAGTTGAAATTCGCCTGG3’；

2）用常规方法将PK-15细胞传代培养，待其长成单层，将TGEV Purdue株冻干毒用DMEM稀释后接种于细胞上，在37℃，5% CO2 培养箱中吸附1h后，弃病毒液，加入DMEM维持液，重新置于37℃，5% CO2培养箱中，待细胞出现明显病变，刮取细胞收获病毒液，-80℃备用；

3）提取 TGEV的RNA；

4）以步骤3)所得的TGEV的RNA为模板，按照下述条件进行RT-LAMP反应：

10×Bst buffer 2.5μL、AMV（5U/μL）0.5μL、Bst DNA 聚合酶8U、Betaine（1mol/L）3μL、Calcein（250μmol/L）3μL、MnCl2 （25mmol/L）0.5μL、MgSO4（100mmol/L）0.5μL、BIP（10mmol/mL）3μL、FIP（10mmol/mL）3μL、LB（10mmol/mL）2μL、F3（10mmol/mL）0.5μL、B3（10mmol/mL）0.5μL、dNTPs （10mmol/L）3μL、模版RNA（7.28μg/μL）2μL，用去离子水补足25μL；反应条件为：62℃1h，80℃10min；

5） 可视化观察RT-LAMP反应结果;

6）琼脂糖凝胶验证可视化RT-LAMP反应结果。

2.如权利要求1所述的猪传染性胃肠炎TGE 的RT-LAMP检测方法，其特征在于，步骤3）提取 TGEV的RNA的方法为：

3-1 )用移液器将20μL蛋白酶K加入一个干净的1.5 mL离心管中;

3-2) 向离心管中加入200μL步骤2）获得的病毒液；

3-3)加入200μL Carrier RNA工作液盖上管盖，涡旋振荡15秒混匀；为了保证裂解充分，样品和Carrier RNA工作液需要彻底混匀；Carrier RNA工作液为缓冲液GB与Carrier RNA溶液的混合液，配制方法按照公式计算, 配制公式为：

n×0.22mL=y mL         mL×28 uL/mL=zμL

n=同时提取的样品个数

y=需要加入缓冲液GB的体积

z=需要加入Carrier RNA

3-4) 在56℃孵育15分钟；简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；

3-5) 加入250μL无水乙醇，盖上管盖并涡旋振荡15秒，在15-25℃放置5分钟；如果周围环境高于25℃，乙醇需要再在冰上预冷后再加入；

3-6) 简短离心以收集附着在管壁及管盖的液体；

3-7) 将RNase-free吸附柱CR2放在收集管中，仔细将离心管中的溶液和絮状沉淀全部转移至RNase-free吸附柱CR2，盖上管盖，8000 rpm（~6000 x g)离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管中；

3-8)小心打开吸附柱盖子，加入500μL溶液RW，盖上管盖，静置2分钟，8000 rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱放回收集管；

3-9) 重复3-8)步骤一次；

3-10)小心打开吸附柱盖子，加入500μL无水乙醇，盖上管盖，8000 rpm离心1分钟，弃废液；

3-11)将吸附柱放回收集管中，12,000 rpm离心3分钟，使吸附膜完全变干，弃废液；

3-12) 将吸附柱放入一个RNase-free的1.5 ml离心管中，小心打开吸附柱的盖子，向膜中央加入20-150ul RNase-free ddH20，盖上盖子，室温放置5分钟12,000 rpm离心1分钟;离心结束后，离心管中收集液即为TGEV病毒基因组RNA。