[发明专利]猪传染性胃肠炎TGE 的RT-LAMP检测方法

说明书

 

技术领域

本发明适用于临床和基层实验室快速、准确地诊断猪传染性胃肠炎。

 

背景技术

猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种高度接触传染性肠道疾病，临床上以病猪呕吐、严重腹泻和失水为主要特征，不同品种、年龄的猪只都可感染发病，尤以两周龄以内仔猪、断奶仔猪易感性最强，致死率高，可达100%^[1]。该病是一种世界性疾病，给畜牧业生产带来巨大的经济损失，早发现、早确诊对该病的防治意义重大。要做到早确诊就需要快速、敏感、特异的诊断方法。

目前，检测 TGEV 的常规方法主要有: 病原学检测，包括：病毒的分离鉴定、电镜检测、免疫荧光法和免疫过氧化物酶法等；血清学检测，包括血清中和试验、酶联免疫吸附试验（ELISA）^[2]等；分子诊断技术，包括：核酸探针杂交技术^[3]、聚合酶链式反应（RT-PCR）技术^[4]、多重RT-PCR 和RT-nPCR方法等。

作为传统的检测方法，TGEV的病原学检测存和血清学检测在着许多问题。

TGEV的分离只能在实验室进行，需要较高的技术水平和较先进的实验条件，操作困难，所需周期长，且TGEV与多种病毒接种细胞后CPE相同或相似，如诸呼吸道冠状病毒、猪流行性腹泻等，因此病毒分离方法显得并不可靠。病毒分离以后为了最终确认该猪组织中的病毒，还需借助其它得检测手段, 如特异性抗TGEV血清做中和试验、免疫荧光(IF)等方法进行最终的鉴定^[5]；通过电镜观察病毒证明，在感染猪肠内容物和粪便中可以发现有TGEV的存在^[6]。实践证明免疫电镜(IEM)比常规电镜(EM)的检测效果更好，前者对检测临床样品或细胞培养物中的TGEV更为敏感，并可以提供病毒血清学的鉴定。但是最终还必须使用特殊的单克隆抗体检测。虽然该两种方法可以作为确诊该病的最终诊断依据，但是成本高、过程复杂、操作时间长。

TGEV抗体的血清学方法检测，最常用的是SN试验，其中微量滴定板和抑制试验和蚀斑减数试验使用最为普遍^[7]。已经建立的间接荧光抗体试验方法不如VN试验的敏感和可靠^[8-9]。相对敏感的被动血凝试验则需要浓缩纯化病毒及致敏红细胞。其他发展的血清学试验包括：检测免疫球蛋白特异性抗体的间接免疫过氧化物酶试验、放射性免疫沉淀试验和“似及对流免疫电泳”^[10-11]。但是，该实验法存在严重的非特异性。

酶联免疫吸附实验 (ELISA)是当前应用最广泛的一种免疫学检测方法，己发展了间接ELISA、双抗体夹心ELESA、竞争ELISA和阻断ELISA等。不同的ELISA方法可检测TGEV抗体或抗原。ELISA方法是常用检测方法，但由于单克隆抗体是针对特定抗原位点，而不同TGEV株这些抗原位点有差异，导致某些样品的漏检^[12]。

分子诊断技术的蓬勃发展给TGEV的检测提供了更多的方法，如RT-PCR、基因芯片技术^[13]、核酸序列依赖性扩增（NASBA）^[14]、实时荧光RT-PCR^[15]、错配扩增突变试验( MAMA) 等，同样，诸多新型核酸扩增技术法均存在不同的缺点，例如：试验周期较长、操作繁琐、灵敏度不高、特异性不强、准确性较低、易受检测材料限制等^[16]， 应用于临床鉴别诊断的实用意义不大^[17]，不适合在基层实验室推广应用^[18]。因此 ，建立一种快速简便的、适用于临床和基层实验室的检测方法十分重要。

环介导等温核酸扩增技术（LAMP）最初是Notomi等^[19] 设计并应用于病毒及其他病原体基因的检测，其特点是针对靶基因的不同区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，于恒温条件下几十分钟内即可完成核酸的扩增反应, 具有较高的敏感性和特异性。逆转录环介导等温核酸扩增技术（RT-LAMP）是在LAMP反应体系中加入一定量的逆转录酶从而实现RNA到DNA的一步扩增。