[发明专利]一种基于DNA折纸的生物分子亲和常数测定方法

说明书

技术领域

本发明属于检测方法领域，特别涉及一种基于DNA折纸的生物分子亲和常数的测定方法。

背景技术

抗体的亲和力（affinity）是指抗原与抗体结合的牢固程度。亲和力越大表示抗体的结合反应越快，抗原抗体复合物越不易解离。抗体亲和力是抗体的结合部位与相应抗原决定簇之间的非共价引力与斥力之和，它是评价抗体质量的重要指标。抗体亲和力的大小以亲和常数表示，亲和力常数（K）是抗原/抗体结合反应的平衡常数。

目前，测定亲和常数的方法有多种，如：硫氰酸盐洗脱法、尿素洗脱法、ELISA法、生物传感器法、表面等离子共振法和竞争结合法等。上述测定方法主要建立在宏观的统计数据基础上，目前还无单分子水平上的测定方法。

亲和常数的测定是基于如下的结合解离作用定理，如下列化学式所示：

反应达到平衡时，其亲和常数计算方法如下列数学式所示：

K=[AbAg]/[Ag][Ab]

其中，[Ag]代表游离抗原浓度，[Ab]代表游离抗体浓度，[AbAg]代表抗原抗体复合物浓度，K为亲和常数。

传统的测定亲和常数的方法不能从上述数学式中直接测定亲和常数，因为无法确定反应中的游离抗原和游离抗体浓度，所以需变换公式进行测定。传统测定方法通常设定其中一组分浓度远远小于另外一组分浓度，如抗原浓度远远小于抗体浓度。这样，反应达到平衡时，就可以认为抗体总浓度为游离抗体浓度，带入变换后的公式计算。目前应用较多的测定生物分子亲和常数的方法主要为酶联免疫分析法（ELISA）和表面等离子体共振法（SPR）。ELISA是测定OD值来计算亲和常数，SPR是计算K_b（结合速率常数）和K_d（解离速率常数）来测定亲和常数K，这两种方法的背景噪声相对来说比都较大，测定过程也相对比较复杂。因此，传统的测定方法不仅需要消耗大量的抗原、抗体，而且实验设定的条件较多，步骤较繁琐而复杂，引入的误差也相对较大。

DNA折纸术是最近几年得到迅猛发展的纳米技术，利用一条长的单链DNA（脚手架链，通常为M13mp18）与相配对的200多条寡核苷酸链(订书订链)短链自组装而成。通过设计不同的寡核苷酸链，可使DNA组装成不同的纳米结构，其结构具有图案可控和编码可循的特征。由于个寡核苷酸链末端可被多种分子修饰，所以在DNA折纸界面上的反应位点具有精确可控的优势。原子力显微镜（AFM)具有纳米级的分辨率，通过检测折纸上特定位置的形貌变化就能够准确判断反应变化的情况，如反应是否发生，以及反应速度快慢等，能够在单分子水平上研究生物分子形貌和分子间相互作用力。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的生物分子亲和常数测定方法无法做到在单分子水平上进行测定，而且实验设定的条件较多，步骤繁琐而复杂，引入的误差也相对较大的问题，利用DNA折纸具有反应位点精确可控的优势以及原子力显微镜（AFM）可以在反应界面上直接观察单个抗原抗体分子复合物的优势，提供一种基于DNA折纸的生物分子的亲和常数测定方法。

为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种基于DNA折纸的生物分子的亲和常数测定方法，其中所述生物分子包括能够彼此结合与解离的反应物Ⅰ和反应物Ⅱ，该测定方法包括以下步骤：

（1）将反应物Ⅰ连接于DNA折纸订书钉链末端，然后和脚手架链自组装形成DNA折纸；

（2）加入反应物Ⅱ，反应达到平衡后利用原子力显微镜扫描成像收集数据，计算出反应物I和反应物Ⅱ复合物的浓度[AbAg]，游离的反应物Ⅰ的浓度[Ag]以及游离的反应物Ⅱ的浓度[Ab]；

（3）将步骤（2）所得数值代入如下公式，K＝[AbAg]/[Ag][Ab]，计算得到所述反应物Ⅰ和反应物Ⅱ的亲和常数K。

其中所述生物分子为本领域常规的单分子之间可发生结合与解离的一对生物分子。所述的生物分子较佳地包括反应物Ⅰ和与之特异性结合的反应物Ⅱ，所述反应物Ⅰ和与之特异性结合的反应物Ⅱ较佳地包括以下各组分子中的一组或多组：抗原和抗体，生物素和亲和素，核酸适配体及其靶分子以及配体和受体。其中还包括已知的其他可以发生特异性结合并且具有亲和常数的物质，这些都在本发明的保护范围之内。例如：可与DNA适配体或RNA适配体相结合的蛋白质、多糖和多肽等物质。本发明所述反应物I和反应物Ⅱ优选地为地高辛和地高辛抗体。