[发明专利]调整反应细胞浓度的流式细胞测速方法

说明书

技术领域

本发明属于流式细胞检测技术领域，具体涉及一种调整反应细胞浓度的流式细胞测速方法。

背景技术

流式细胞仪是能对悬浮细胞进行逐个计数并记录其相关参数的细胞分析仪器，优势在测量速度快，细胞检测量大，能多参数分析，在临床上有广泛的应用。

流式细胞仪结合荧光单抗技术为临床上造血干细胞绝对计数提供了一种快速、定量、重复性好的方法。

目前造血干细胞移植技术已越来越多地用于治疗血液系统疾病、恶性肿瘤及一些遗传性疾病。在治疗恶性血液病时，大剂量化疗或放疗摧毁病人的骨髓后，给病人移植造血干细胞可以帮助病人重建骨髓，有助于恢复病人的造血机能和免疫功能。实体肿瘤病人通过造血干细胞移植可以抗衡大剂量化疗导致的毒副作用，与大剂量化疗相配合的造血干细胞移植已在临床大大提高了某些肿瘤病人的长期存活率。因此，造血干细胞移植对多种疾病的治疗具有重要意义，而准确的造血干细胞绝对计数对于干细胞移植的成败又十分重要。

对于有剂量要求的造血干细胞移植方案而言，精确的干细胞计数十分重要，此重要性还体现在动员及白细胞分离过程中，如通过计数细胞水平判断动员是否成功、何时为最佳采集时间以及采集到的干细胞数量是否足够等等。由于干细胞所占的比例很小，在外周血中不到0.1%在骨髓中也只占单个核细胞的1%至4%，因此利用流式细胞仪在大量细胞中快速准确地筛选并计数对实验技术的要求非常高。实践中发现，被检细胞的浓度与反应抗体间的适宜比例是检测成功并至结果准确的关键要素之一，细胞浓度通常通过细胞计数方法得到，传统的细胞计数方法需要血细胞计数器和显微镜，或者采用全自动血球计数仪进行细胞计数，每种方法都有一定的局限性。由此，发明人结合实际工作经验，另辟蹊径，不需要测定具体的细胞浓度，通过与设立的对照组在流式细胞仪上所测得的流速进行比对，建立了这套用于造血干细胞绝对计数时调整反应细胞浓度的流式细胞测速方法。该方法具有不增加任何成本，快速简便、易于流式细胞专业技术人员操作，提高检测精确度和成功率的优势。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于造血干细胞绝对计数时调整反应细胞浓度的流式细胞测速方法。

为解决上述技术问题，本发明的思路是借助流式细胞仪本身具备的细胞流速电子控制功能，设立抗凝新鲜外周血做对照，同时将动员后采集液与对照组分别在流式细胞仪上所测得的流速进行比对，进而调整动员后采集液的反应细胞浓度在适宜范围，从而达到精确测定造血干细胞绝对计数的目标。

具体的技术方案如下：

调整反应细胞浓度的流式细胞测速方法，它包括如下步骤：

（1）准备抗凝新鲜正常人外周血0.5mL，动员后外周血采集液0.5mL；

（2）流式细胞仪开机后首先进行仪器质控，保持电子仪器工作状态稳定；

（3）取正常人外周血50μL加500μl生理盐水放入同一上机管中，采用流式细胞仪的中档进行测速，反复10次，记录每秒通过的细胞数，绘出测速所得的上下限范围；

（4）取动员后外周血采集液50μL加500μL生理盐水放入同一上机管中，采用流式细胞仪中档进行测速，反复10次，记录每秒通过的细胞数；

（5）将步骤（4）的得到的细胞数数据与步骤（3）得到的细胞数数据进行比对，确定动员后外周血采集液在造血干细胞CD34绝对计数分析中应稀释的倍数；

（6）取稀释后的动员后外周血采集液50μL加500μL生理盐水放入同一上机管中，采用流式细胞仪中档进行测速，当采集液最终的细胞数落在步骤第（3）测速所得的上下限范围内时，则该浓度采集液就可以进行造血干细胞CD34绝对计数的实验；

（7）进行造血干细胞CD34绝对计数的常规操作流程。

步骤（5）中，动员后外周血采集液在造血干细胞CD34绝对计数分析中应稀释或浓缩的(删)倍数的计算方法为：步骤（4）得到的外周血采集液每秒通过的细胞数除以步骤（3）得到的正常人外周血每秒通过的细胞数，结果取整数即为稀释的倍数。

步骤（7）中，造血干细胞CD34绝对计数的常规操作流程包括如下步骤：

（7a）分别向已编好号的试管中加入单克隆抗体CD45和CD34试剂各5μL，加步骤（6）确定好的取稀释后的动员后外周血采集液50μL，混匀室温避光反应20分钟；

（7b）加OPTILYSE 250μL，混匀室温避光放置10分钟；

（7c）加pH7~7.2的PBS缓冲液250μL，静置5分钟；

（7d）加FLOW COUNT 50μL；

（7e）上流式细胞仪检测。