[发明专利]适用于黄瓜花叶病毒不同亚组株系基因组的通用引物及扩增方法

说明书

  

技术领域

本发明涉及一种用于烟草病毒基因组扩增和烟草病毒病检测的通用引物及扩增方法，尤其是适用于烟草黄瓜花叶病毒不同亚组株系基因组扩增和烟草黄瓜花叶病毒病检测的通用引物及扩增方法，属于烟草病害研究领域。 

  

背景技术

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)能侵染包括茄科、十字花科、豆科等经济作物在内的1000多种单子叶和双子叶植物，造成严重的经济损失，是世界范围内最重要的植物病毒之一[1]。烟草是茄科植物，作为一种重要的经济作物，在世界各地种植广泛。黄瓜花叶病毒是危害烟草的主要病毒病害[2]。 

黄瓜花叶病毒是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的典型成员，具有典型的三分体正义单链RNA (Positive sense single．Stranded RNA，+ssRNA)基因组，三条基因组分别为RNAl、RNA2和RNA3。根据血清学和核酸序列同源性，CMV株系被划分为3个亚组：IA、IB和Ⅱ[3,4]。作为一种典型的RNA病毒，CMV基因组序列极易发生变异[5]，对于亚组I和亚组II，组内各株系间的核酸序列同源性在88%以上，而亚组间株系核酸序列同源性只有69%-77%[1]。如此低的序列同源性，给CMV全基因组PCR扩增带来很大困难。目前，测定CMV基因组全序列，首先要确定CMV株系，主要根据CMV基因组部分区域如CP基因和3′UTR区域的基因序列确定；再根据确定的株系设计特异性全基因组扩增引物进行扩增。这样设计的特异性引物，用于同组其它株系或其它亚组株系基因组全序列扩增时，由于不同亚组株系间序列同源性低，引物通用性差，匹配性不高，将直接造成扩增失败。目前还没有可以适用于CMV所有亚组不同株系基因组全序列扩增的通用引物及一步法RT-PCR扩增方法的报道。 

  

发明内容

本发明的目的正是针对上述现有技术所存在的问题而专门提供的一种适用于黄瓜花叶病毒不同亚组株系基因组的通用引物及扩增方法，即提供一套能够用于烟草CMV检测，特别是用于烟草CMV所有亚组株系全基因组扩增的通用引物，本发明的目的还在于提供利用该套引物扩增侵染烟草黄瓜花叶病毒不同亚组株系基因组扩增和检测CMV的一步法RT-PCR方法。 

本发明的上述技术目的通过以下技术方案实现。 

本发明的通用引物的名称和核苷酸序列如下： 

P11：GTTTATTTACAAGAGCGTACGGTTCAA；

P12：CATGTGATGGGGGAACGTGT；

P21：GAGAAGAATGGGACGTGATATCATC；

P22：TGGTCTCCTTTTGGAGGCCCC；

P11：GTTTATTTACAAGAGCGTACGGTTCAA；

P31：CGTTCTCGAAGGCATCTCTGG；

P41：CGATTCCAGAGATGCCTTCG；

P42：GTTTTCCCAGTCACGACTGGTCTCCTT；

P51：GTAATCTTACCACTGTGTGTGTGCG；

P52：ACGGTAGAATCAAATTTCGGCAA；

P61：CGCTCGCCTGTTGAAGTCG；

P42：GTTTTCCCAGTCACGACTGGTCTCCTT。

引物配对方式如下： 

P11和P12配对；P21和P22配对；P11和P31配对；P41和P42配对；P51和P52配对；P61和P42配对。

利用上述的通用引物扩增CMV不同亚组株系基因组序列的方法，包括以下具体步骤： 

(1)提取样品RNA，以其为模板，以本发明提供的引物，使用一步法RT-PCR进行扩增；

(2)PCR产物琼脂糖胶电泳检测，根据产物条带有无和大小判断样品是否有CMV感染，目的条带回收，连接T载体，转化细菌感受态细胞；

(3)进行蓝白斑筛选和PCR鉴定，确定阳性菌株，阳性菌株放大培养后，提取质粒；

(4)阳性质粒测序，结果分析，确定是否为CMV，测序结果经过拼接，得到CMV基因组全序列。