[发明专利]双束激光质谱法原位检测动物组织中药物分子的方法

说明书

技术领域

本发明属于一种小分子药物开发的检测技术领域，特别涉及一种应用双束激光质谱法（L2MS）检测动物组织中药物分子的方法。

背景技术

双束激光质谱法（Two-step Laser Desorption/Laser Ionization MassSpectrometry,L2MS）是采用两束激光分别完成气化/解析和电离的任务，L2MS有如下优点：其一，因解析激光和电离激光在时间和空间上是分开的，因此可以根据实际的需要很方便的单独优化两束激光的能量和波长；其次，该实验技术所需要的样品量极少，也不需要在待测样品中人为地添加其它的化学物质作为基质，样品准备简单，避免了样品的二次污染。双束激光质谱技术以其独特的优点在分析化学与生命科学领域日益受到重视。

双束激光质谱法在最近的一二十年间获得了很大的发展。其应用首先是在生物领域，包括短肽，氨基酸等生物小分子，药物分子，化学添加剂等化学分子的检测，Luke Hanley，Richard N.Zare等研究团队都有专门的小组进行此方面的研究，近年来都有文章发表，在此基础上发展起来的表面分析技术可发展成为一种新的生物芯片分析技术。另外，该技术与显微成像技术相结合，有望研发出一种新的质谱成像技术，并应用于生命科学领域。最近Hanley教授发表了一篇关于生物质谱成像方面的综述性文章，介绍了双束激光质谱方法在该方面的一些最新进展，说明在生物质谱检测方面，该技术方法将具有很好的发展前景。

亚甲基蓝（Methylene Blue，MB）为一种噻嗪染料类化合物，为水溶性色素。高浓度[(5～10)mg/kg]时直接使血红蛋白氧化为高铁血红蛋白，低浓度[(1～2)mg/kg]时,在还原型辅酶Ⅰ脱氢酶的作用下，能将高铁还原型蛋白还原为血红蛋白。早在20世纪30年代就发现亚甲蓝可与病毒的核酸及脂质包膜结合，在可见光的作用下，使病毒包膜破损，核酸断裂，进而导致大多数的脂质包膜病毒和部分非脂质包膜病毒失活。随后，亚甲基蓝的光动力治疗一直被人们所利用。但是，目前对亚甲基蓝的检测主要还是比较的少，主要是拉曼光谱以及色谱的方法，但都无法在生物组织内部对亚甲基蓝进行检测。因此，发展一种利用双束激光质谱法简单快速检测生物组织内药物小分子的方法显得尤为重要。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种双束激光质谱法原位检测动物组织中药物分子的方法，该方法快速原位、无需前期处理，方便、灵敏度极高。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种应用双束激光质谱法原位检测动物组织中药物分子的方法，包括以下操作步骤：

（1）将药物分子溶液加到离体肿瘤组织上，使药物分子溶液在离体肿瘤组织中充分扩散；

（2）将经过步骤（1）处理的离体肿瘤组织进行冷冻，用包埋剂将离体肿瘤组织包埋后，用冷冻切片机进行切片，得到离体肿瘤组织切片；

（3）对承载基底石墨棒进行清洗处理，将步骤（2）处理所得离体肿瘤组织切片放在已处理的石墨棒上，把石墨棒固定在双束激光质谱仪的进样杆上，经进样系统进入双束激光质谱仪的真空设备中进行检测；

（4）开启双束激光质谱仪，双束激光质谱仪中的两台固体激光器分别依次发射脉冲激光，发射的第一束脉冲激光为解析激光，解析激光聚焦后进入电离室中并且照射在石墨棒上的离体肿瘤组织切片上，经过18～30μs延迟，再发射第二束脉冲激光，第二束脉冲激光经过气体池三倍频后转化为真空紫外激光，在气体池出光口用平凸镜聚焦分离第二束脉冲激光和真空紫外激光；真空紫外激光聚焦后以平行于石墨棒的方向进入电离室中并且与第一束脉冲激光实现交叉，再对第一束脉冲激光气化-解析后产生的气羽进行电离，电离的离子经过飞行管飞行，被微通道板检测，再通过数据采集装置显示及采集，最后在电脑上进行数据处理。

所述步骤（1）是在无菌条件下进行操作的；步骤（1）所述离体肿瘤组织为被Hela细胞感染的老鼠的皮下离体肿瘤组织；所述离体肿瘤组织的大小为15mm×5mm×4mm；所述药物分子溶液的浓度为1×10^-4mol/L，其用量为10～100μl；所述充分扩散的时间是10～20min。

步骤（1）所述药物分子溶液是亚甲基蓝溶液。

步骤（2）所述进行冷冻是先将经过步骤（1）处理的离体肿瘤组织投入用干冰冷却的异戊烷中15～20s，再放入-80℃的冰箱里冷冻保存；所述包埋剂是OCT冰冻切片包埋剂；所述冷冻切片机是在-19～-24℃的环境下工作，冷冻切片机工作前提前开机1.5～2.0小时；所述切片的厚度为200～400μm。