[发明专利]蛋白质微阵列芯片的临界值一级参考品的制备方法、临界值系数的确定和实验结果判定方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物芯片技术领域，具体涉及一种用于联合检测自身抗体蛋白质微阵列芯片的临界值一级参考品的制备方法、临界值系数的确定方法以及实验结果判定方法。

背景技术：

随着人们对自身免疫性疾病（autoimmune diseases，AID）的研究深入，发现自身免疫性疾病累及全身各个系统，种类多达40余种，自身免病患者中，有很大一部分病人的血清或其它体液中可检测到一种或多种高效价的自身抗体，自身抗体数量达到上百种（World J Gastroenterol，2010,16:3616-3629.）。自身抗体检测对AID的辅助诊断、病情评估、疗效监测以及预后判断均具有重要的临床应用价值。

蛋白芯片微阵列技术（Protein Microarray）作为一种高通量、高灵敏度、特异性强、快速便捷的检测分析方法，在以自身抗体为特征的自身免疫性疾病的诊断、鉴别与筛查中得到了广泛应用，目前常见的商业化蛋白质微阵列芯片技术检测平台有FIDIS（微珠芯片）(Ann Biol Clin(Pairs)2005,63:51-58.），AtheNA（微珠芯片），Luminex和Bio-Rad等公司研发的自身抗体检测系统（Anal Bioanal Chem,2009,393:1407-1416.）。此类芯片能同时对多个样本多个指标进行并行检测分析，产品性能与传统方法相当，但自动化程度和检测速度明显提高，标本用量减少，更加适合临床常规自身抗体的检测需求。

近来年蛋白质微阵列芯片的多重新技术发展迅速，且既可用于实验室研究又可用于临床常规分析，该技术的敏感度和特异度不断得到提升（Arhtritis Rheum，2005,52:2645-2655.），蛋白质微阵列芯片技术似乎是未来自身抗体分析的首选方法。

利用蛋白质微阵列芯片技术检测样本所得测量值是连续的数值，临界参考值（cut-off）的确定对检测结果的判断有密切关系，也直接影响蛋白质微阵列芯片技术的灵敏度与特异度，因而临界参考值的研究在蛋白质微阵列芯片技术平台中至关重要。

在自身抗体蛋白质微阵列芯片的临界值（cut-off）研究中，有文献报道（Clinical Chemistry,2004,50(2):416-422.），利用Human IgG的浓度-灰度标准曲线，选取各个自身抗体指标的临界值（cut-off）范围内所有共有的最低灰度值所对应的Human IgG的浓度作为临界值对照品的浓度，当被测样本中自身抗体指标的信号值大于临界值对照品信号值时，结果判断为阳性，反之，则结果判断为阴性。也有文献报道，通过大量健康人阴性血清检测实验，利用统计学数据处理方法，计算出每个自身抗体指标的临界信号值（cut-off），在此后的实验过程中，当某个指标的检测信号值大于该指标的临界信号值（cut-off）时，结果判断为阳性，反之，则结果判断为阴性。在这两种自身抗体蛋白质微阵列芯片的临界值（cut-off）研究中，前者利用Human IgG的浓度-灰度曲线有替代各个自身抗体指标的浓度-灰度曲线是否合理，是值得商榷的。后者将每次实验过程中引入的信号波动忽略不计，这与在蛋白质微阵列芯片化学发光法实验过程中由于实验操作不能标准化、人为因素较大而导致实验信号波动较大的实事不相符合。

发明内容：

本发明要解决的问题是之一在于针对目前在利用蛋白质微阵列芯片---化学发光法技术联合并行检测多个自身抗体的实验过程中，实验结果判断方法的不足，提供一种临界值一级参考品的制备方法。

本发明要解决的问题是之二在于提供一种利用上述临界值一级参考品确定阳性对照品中各自身抗体指标的临界值系数的方法。

本发明要解决的问题是之三在于针对目前在利用蛋白质微阵列芯片---化学发光法技术联合并行检测多个自身抗体的实验过程中，实验结果判断方法的不足，提供一种科学合理的实验结果判定方法，有效地消除出每次实验操作时引入的信号偏差对检测结果判断的影响，同时保证了实验结果判定的可靠性、稳定性，提高产品的灵敏度和特异度。