[发明专利]一种恩拉霉素高产菌株及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于生产抗生素的菌株，具体地说，涉及一种高产恩拉霉素的菌株及其制备方法和应用。

背景技术

恩拉霉素是由真杀菌链霉菌（Streptomyces fungicidious）发酵产生的一种由十几种氨基酸和不饱和脂肪酸结合而成的环状多肽类抗生素。以往用于生产恩拉霉素的杀真菌链霉菌菌株大多是从野生菌株中筛选得到的，其生产水平较低。中国专利ZL 201010528367.2公开了一种杀真菌链霉菌突变菌株FYFJ03（保藏号CGMCC No.4113），其筛选方法是：首先采用5-溴尿嘧啶诱使出发菌株突变，产生突变株，然后采用金黄色葡萄球菌，按照生物效价法对突变株进行筛选，得到高产恩拉霉素的菌株。该方法虽然在一定程度上提高了菌株的生产能力，但是由于仅采用了化学诱变，且筛选方式单一，因此菌株生产能力的提高有限。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产恩拉霉素的菌株，同时提供上述菌株的筛选方法，以及提供该菌株在恩拉霉素生产中的应用。

为实现本发明目的，本发明提供了一种分类名称是杀真菌链霉菌（Streptomyces fungicidious）DCS067（以下简称DCS067）的恩拉霉素高产菌株，其保藏号是CGMCC No.6220，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会（CGMCC），保藏日期是2012年6月14日。

本发明所提供的DCS067菌株其微生物学特征如下： 

单菌落的形态为：菌落直径2-3mm，孢子灰色或白色，丰满。显微镜观察孢子圆形或椭圆形。

本发明提供的DCS067的制备方法，包括以下步骤：

a、孢子悬液Ⅰ的制备：取杀真菌链霉菌的出发菌株，接种于斜面培养基上，在28.0±0.5℃、相对湿度40%-60%条件下培养5-8天，然后加入无菌水，将孢子刮下，混匀，得到孢子悬液Ⅰ；

b、有机溶剂处理：向孢子悬液Ⅰ中加入无菌有机溶剂，振荡后静置，分层，取水相得到孢子悬液Ⅱ；所述振荡可以采用漩涡振荡器振荡15-60 s，静置时间最好为15-30min。

c、紫外诱变：将孢子悬液Ⅱ置于灭菌的培养皿中，于波长为254nm的紫外灯下照射45-60s；照射时，最好是在功率为30W的紫外灯下垂直距离30cm处照射。

d、抗性筛选：将诱变处理后的孢子悬液Ⅱ涂布在含有抗生素的分离培养基上，在28.0±0.5℃、相对湿度40%-60%条件下培养5-8天，生成具有抗生素耐药性的若干单菌落；培养时最好第一天正置，第二天起倒置培养；分别挑取上述单菌落，接种于斜面培养基上，在28.0±0.5℃、相对湿度40%-60%条件下培养5-8天后，接种于种子培养基上，在28.0±0.5℃，200~220 rpm条件下培养26-30h后，接种于发酵培养基上，在28.0±0.5℃，200~220 rpm条件下培养9-12天，得到发酵液，采用HPLC法测定发酵液中恩拉霉素效价，其中，效价最高的发酵液对应的菌株即为本发明所述杀真菌链霉菌（Streptomyces fungicidious）DCS067。

本发明首先将菌株孢子悬液经过有机溶剂处理，去除了孢子表面的多糖被、蛋白类物质等附着物，有利于后续的诱变和筛选。这是因为菌株细胞在生长繁殖过程中，孢子周围会形成主要由多糖被以及蛋白类物质组成的附着物，此类附着物不仅能阻挡紫外线的作用，还能防碍抗生素的渗入，同时，多糖被中还含有较高浓度的抗生素降解酶，进一步阻止了抗生素对深层孢子的影响。去除上述附着物，能够使孢子更好地暴露于外部环境中。本发明在后续步骤中，采用了紫外诱变和抗生素抗性筛选相结合的方式，克服了以往单一诱变的不足，进一步提高了突变菌株的恩拉霉素产率。与出发菌株相比，本发明所述菌株的恩拉霉素产率提高了47.80%。本发明a步骤所述孢子悬液Ⅰ中孢子浓度最好为10¹¹-10¹³个/mL或者是吸光度A₆₀₀为1.0-2.0；该浓度或吸光度下的孢子悬液，易于除去孢子表面的附着物（多糖被、蛋白类物质），同时还具有良好的繁殖性能。本发明b步骤所述有机溶剂最好是经灭菌处理的苯酚、三氯甲烷、正十六烷、正己烷、正辛烷、正十二烷、正辛醇、二甲苯中的任意一种或几种的混合物。其中，更优选的组合是苯酚和三氯甲烷的混合物；混合物中，苯酚和三氯甲烷的体积比最好为25:4。采用上述混合物对孢子悬液Ⅰ进行处理时，能够更好地除去孢子表面的多糖被、蛋白类物质。