[发明专利]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原I12C制备中的纯化方法

权利要求书

1.一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程疫苗候选抗原I₁₂C制备中的纯化方法，其特征在于，该抗原I₁₂C的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其纯化方法包括以下步骤：

A）收集自构建表达抗原I₁₂C的大肠杆菌工程菌高密度发酵的菌体；

B）采用高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶切、缓冲液置换、Resource层析、凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的I₁₂C进行纯化，获得了高纯度的I₁₂C。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤B具体如下：

1）高压破菌：将高密度发酵的抗原I₁₂C的大肠杆菌菌体以pH7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；

2）硫酸铵分步沉淀：4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟，收集上清；上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟，收集沉淀；

3）沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量：体积比1：10比例加入pH7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟，收集上清；

4）GST亲和纯化：选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用PBS-Tween80pH7.0-7.5条件下对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶（PP酶）进行酶切洗脱：

5）缓冲液置换：使用缓冲液A（10-20mM PB，pH7-9，5%甘油，1mM EDTA）平衡层析系统及Desalting层析柱，将步骤4）获取的样品通过Desalting层析柱；

6）Resource层析纯化：步骤5）收集的样品，使用缓冲液A平衡层析系统 及Resource层析柱，采用换缓冲液B（10-20mM PB，1M Nacl，pH7-9，5%甘油，1mM EDTA）梯度洗脱；

7）凝胶过滤层析纯化：将步骤6）纯化获得的样品，使用凝胶过滤Superdex层析柱纯化，采用缓冲液C（10-20mM PBS,pH7.0-7.5）平衡层析系统及层析柱，去除痕量非目标蛋白等杂质，分离纯化目标蛋白，置换缓冲液。

3.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤1）所采用生产或中试纯化中的60-80MPa高压匀浆破菌技术，破菌率大于96%，离心获取破菌上清。

4.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤2）硫酸铵分步沉淀。

5.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤3）目的蛋白沉淀复溶。

6.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤4）所述的GST亲和纯化，所使用的填料为GST-Sepharose 4B或GST-Sepharose 6B或GST-Sepharose FastFlow或GST-Sepharose HP。步骤4）所使用的Prescission Protease酶带有GST标签，以利于去除PP酶。

7.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤5）Resource层析准备。所用层析柱为HiPrep 26/10 Desalting柱。

8.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤6）所述的纯化方法Resource层析的填料为Source15Q。

9.根据权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，步骤7）所述的凝胶层析柱为Superdex75或Superdex 200或Superdex HR 10/30。

10.根据权利要求1至9任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述抗原是通过以下步骤制备的：

1）设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码HI2蛋白活性片段的核酸序列；

2）将步骤1）所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；

3）诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白。