[发明专利]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原I12C制备中的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术制药领域，涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组基因工程疫苗候选抗原I₁₂C制备中的纯化方法。

背景技术

由战创伤及感染引起的全身性炎症反应综合征和脓毒症/脓毒症休克是导致战创伤病人死亡的主要原因之一，其病死率高达50-80％，至今尚无有效防治药物，其中金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA)是最常见的感染源之一。随着抗生素长期广泛地使用，金黃色葡萄球菌耐药性问题日益突出，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)就是其中典型代表，因其传播途径广泛，易致暴发流行，又由于其致病性强，多重耐药而成为临床上治疗的难点。自1961年英国首先报道以来，以惊人的速度在世界范围内蔓延。MRSA目前已成为全球ICU病房、烧伤、大型手术等感染率最高的医院內感染病原菌。

来自2011年“MRSA院内感染诊治策略新进展”会议最新的资料显示，我国内地医院MRSA院内感染发生率约为8%，每例院内感染患者平均住院时间延长14天，花费增加6542元，全国每年因医院感染MRSA造成的直接损失超过150亿元。临床上抗MRSA感染治疗面临的挑战不断增加，已很难有效地控制MRSA感染、迅速降低感染患者死亡率。为此，研发确实有效的疫苗，对控制MRSA引起的暴发感染流行，为提高人民健康水平、减轻群众经济负担，都具有显著的理论指导和现实意义。

由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌致病因子包括荚膜多糖、ClfA、IsdB、肠毒素、TSST-1、α-溶血素以及凝固酶等数十种，且含量较低，直接从全菌中分离纯化出保护性抗原的难度较大，方法繁琐，不利于疫苗的产业化制备。

发明内容

本发明的目的，是提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组亚单位基因工程疫苗I₁₂C的中试纯化方法。该方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高。采用本发明方法纯化的抗原I₁₂C，其纯度≥99%，完成整个纯化过程后无需额外再置换缓冲液，经鉴定本发明人构建获得的I₁₂C分子量约为46kD。

本发明采用了以下步骤：

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程疫苗候选抗原HI2制备中的纯化方法，该抗原I₁₂C的氨基酸序列如(Seq 2)所示，其纯化方法包括以下步骤：

A）收集自构建表达抗原HI₂的大肠杆菌工程菌高密度发酵的菌体；

B）采用高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶切，Resource层析、凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的I₁₂C进行纯化，获得了高纯度的I₁₂C。

所述步骤B具体如下：

1）高压破菌：将高密度发酵的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程蛋白I₁₂C的大肠杆菌菌体以pH7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清；

2）硫酸铵分步沉淀：4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟，收集上清；上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟，收集沉淀；

3）沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量：体积比1：10比例加入pH7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟，收集上清；

4）GST亲和纯化：选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用PBS-Tween80 pH7.0-7.5条件下对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶（PP酶）进行酶切洗脱：

5）缓冲液置换：使用缓冲液A（10-20mM PB，pH7-9，5%甘油，1mM EDTA）平衡层析系统及Desalting层析柱，将步骤4）获取的样品通过Desalting层析柱；

6）Resource层析纯化：步骤5）收集的样品，使用缓冲液A平衡层析系统及Resource层析柱，采用换缓冲液B（10-20mM PB，1M Nacl，pH7-9，5%甘油，1mM EDTA）梯度洗脱；