[发明专利]一种半夏离体球茎的高效诱导方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种中药组织培养方法，尤其涉及一种半夏离体球茎的高效诱导方法。

背景技术

半夏以球茎入药，具有燥湿化痰、降逆止咳、消肿散结、抗早孕、抗肿瘤等多种功效，是我国特有的一种大宗传统中药材。随着药理研究的深入，半夏的市场需求量越来越大。半夏一直以野生资源为主，由于人们过度采挖和土地的精细耕作，使得野生半夏资源近乎枯竭。尽管半夏已经推广人工栽培，但由于长期采用小球茎作为种球，导致病毒感染不断积累在球茎中，造成半夏产量和药用成分极不稳定的现象。为了解决半夏资源保护和市场需求的矛盾，我国对半夏组培快繁技术的研究和应用已迅速展开。常见的半夏组织快繁体系是通过外植体诱导愈伤组织、愈伤组织分化出苗、继代增殖、生根、炼苗训化、组培苗移栽等环节，程序繁琐，而且移栽成活率不高。组织培养中的胚状体具有可发芽、不可生根的特点，所以不用生根就能获得完整植株，而且还有繁殖速度快等优点，已经广泛应用于生产实践。在适宜的组培条件下，半夏外植体诱导形成的离体球茎外形、大小均匀。另外，离体球茎还可直接作为繁殖材料应用于生产，节约了原种，大大缩短大田生长周期，避免了种球远程运输和贮存过程中存在的种种问题，具有较广阔的应用前景。通过检索发现，半夏报道的胚状体诱导率一般都只在50%-60%。

在CN102160523A专利中，用适宜浓度的灵发素可使半夏叶柄的胚状体诱导率提高80～100%，但没有离体球茎的形成。在CN100367846C专利中，用多效唑、活性炭、赤霉素、脱落酸、二氢茉莉酸丙酯、糖、琼脂粉等复合培养基实现了半夏离体球茎的形成，但其所用试剂较多，配置繁琐，且前期需要经过诱导、出苗、生根等生产程序，不适合于大规模生产。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明采用了一种半夏叶柄胚状体及离体球茎的高效诱导方法，解决了现有技术中半夏组织快繁体系移栽成活率不高的问题；解决了半夏组培程序繁琐、不适于大规模生产的问题；保证半夏胚状体诱导率，又能促使离体球茎生成；最终解决半夏资源保护和市场需求矛盾的问题。

一种半夏离体球茎的高效诱导方法，主要包括以下步骤：

（1）外植体选择：选择半夏叶柄、嫩叶、茎尖、株芽、球茎中的任一种作为外植体；

（2）胚状体诱导培养：配制胚状体诱导培养基为：MS+6-BA 0.1～0.5mg/L+IBA 0.1～0.5mg/L+市售白糖3～6%+琼脂粉0.45～0.6%，pH5.8～6.0；将步骤（1）所得外植体切断为长0.8～1.2cm的继代扩繁材料，接种在胚状体诱导培养基中，23℃～27℃、光照1200Lx、12h/d条件下培养30～40天；

（3）离体球茎诱导培养：配制离体球茎诱导培养基为：1/2MS+6-BA 0.1～0.3mg/L+NAA 0.1～0.2mg/L+市售白糖3～9%，pH 5.8～6.0；将步骤（2）所得的胚状体，以1:2的比例接种于离体球茎诱导培养基中，23℃～27℃，室内自然光照条件下培养40～45天，胚状体就长成一粒粒的离体球茎；

（4）大田移栽或贮藏：将离体球茎取出，将黏附的培养基冲洗干净，阴干表面的水分，直接进行大田移栽，或者贮藏起来。

所述步骤（3）中的培养容器为透明的玻璃瓶和/或塑料袋。

所述步骤（1）中的外植体优选为叶柄。

所述步骤（1）中的外植体在切断前经过常规灭菌处理。

所述步骤（2）中的胚状体诱导培养基为：MS+6-BA 0.2～0.4mg/L+IBA 0.2～0.4mg/L+市售白糖3～6%+琼脂粉0.5～0.55%，pH5.8～6.0。

所述步骤（3）中的离体球茎诱导培养基为：1/2MS+6-BA 0.2～0.3mg/L+NAA0.15～0.2mg/L+市售白糖5～8%，pH 5.8～6.0。

所述步骤（2）和步骤（3）中的温度条件为24℃～26℃。

所述步骤（2）和步骤（3）中的培养基经过常规湿热灭菌处理20～30min。