[发明专利]一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于鱼类病毒检测技术领域，具体涉及一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒，还涉及一种利用鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法。

背景技术

鲤春病毒血症病毒（Spring viraemia of carp virus,SVCV），属单分子负链RNA病毒目（Mononegavirales），弹状病毒科(Rhabdoviridae)，水泡性口炎病毒属(Vesiculovirus)的暂定种，目前仅有一个血清型。SVCV引起的鲤春病毒血症(Spring Viraemia of Carp，SVC)是一种急性、出血性并有高度传染的流行病，严重危害渔业生产并能造成毁灭性打击。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必报的重要疫病。2008年我国新颁布的动物疫病名录中将其列为一类动物疫病，是新中国成立以来第一个也是唯一一个鱼类病毒疫病被列为一类传染病。

SVC对水产养殖特别是鲤科鱼类养殖的危害巨大。由于暂时没有较好的防治药物和方法，对该病的防控需要依赖实验室的诊断，因此建立快速准确的检测方法至关重要。SVCV检测的“金标准”是通过细胞培养分离病毒，利用免疫学技术或分子生物学技术进行鉴定，这个过程耗时长，程序复杂。另外制备高效价抗血清困难，也限制了免疫学方法的使用。OIE水生动物疾病诊断手册、我国关于SVCV检测的国标和行标，已经将RT-PCR列为诊断方法，但是RT-PCR方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适用于现场快速检测及基层普及应用。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法（国际专利公开号WO 00/28082），针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。逆转录环介导恒温扩增(RT-LAMP)是在反应液中加入一定量的逆转录酶，实现RNA的一步扩增。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短反应时间。

发明内容

本发明的一个目的是在于提供了一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒，根据GenBank公布的SVCV毒株的N基因片段编码区序列(U18101)，应用PrimerExplorer V4（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）在线软件设计特异性引物，利用RT-LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对鲤春病毒血症病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。

本发明的另一个目的是在于提供了一种利用鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法，本方法仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的SVCV，能检测SVCV感染的病鱼组织，能检测SVCV感染的细胞（例如EPC细胞），非常适用于SVCV的现场快速检测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒，包括以下成分：

该试剂盒包括以下成分：10×ThermoPol Reaction Buffer；Bst DNA聚合酶（NEB）；dNTPs；AMV逆转录酶（BBI）；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine（Sigma），MgCl₂，DTT（Invitrogen）,1000×SYBR Green I（Invitrogen）。

F3：5，-GGGATAGCTTCGGACACAAG-3，；

B3：5，-CCATCAGCAAAGTCCGGTAT-3，；

FIP：5，-GTTTCCCATCTGGTAGCCCGTCTTTTAGATCGGGCCTTTTAACCTG-3，；

BIP：5，-AGGTGAGTGCTGAGGATGATGCTTTTTTGCCCTTCCCACTCTGT-3，。

一种利用鲤春病毒血症病毒RT-LAMP检测试剂盒检测鲤春病毒血症病毒的方法，其步骤是：

1、病毒RNA的获取：

采用或LS试剂或柱吸附洗脱法等提取样本总RNA。

2、RT-LAMP扩增：