[发明专利]一种bar/PAT蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种分泌抗bar/PAT蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，保藏号为CGMCC No.6341。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体。

3.权利要求1所述的杂交瘤细胞分泌的抗bar/PAT蛋白单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

基因序列的优化和基因合成

根据Genebank的Bar基因序列，对Bar基因核苷酸序列进行核苷酸和氨基酸序列比对；在氨基酸序列不变的情况下进行密码子优化，使得基因序列适合于大肠杆菌表达；

2）原核表达载体构建

将合成的基因片段连接入pET-28a载体，连接后的产物转化至DH5a感受态细胞中；筛选阳性克隆进行测序鉴定；连入外源片段的质粒并命名为pET-Bar；

3）PAT蛋白表达和分离纯化

将pET-Bar质粒转化到BL21（DE3）感受态细胞中；用终浓度为1mM的IPTG诱导已BL21（DE3）细胞中的Bar基因表达；确定目的蛋白的表达，并分离纯化；

4）单抗制备

用纯化bar/PAT蛋白腹腔注射BALB/C小白鼠，用福氏完全佐剂；经15天后进行二次相同剂量免疫，用福氏不完全佐剂；再15天后进行三次免疫，用加倍剂量的纯蛋白不加佐剂；3天后取脾细胞进行融合；

　  将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)按比例在无血清的DMEM培养基中混匀，离心去除培养基，用50％PEG3350作为融合剂融合，用DMEM培养基终止融合后，离心，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔含有饲养细胞的细胞板中，37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养；细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底10％-50％时，常规间接ELISA方法筛选阳性孔；

筛选出的特异性强阳性孔用常规的有限稀释法克隆，获得单抗细胞株DG-4C2；细胞株DG-4C2进一步扩大培养，用于制备单抗腹水和液氮冻存；

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷，7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，小鼠腹部明显膨大时采取腹水，离心收集上清液，即为单克隆抗体腹水；辛酸-硫酸铵盐析法纯化单克隆抗体，-70℃保存；即为可专一识别PAT蛋白的抗体。

4.权利要求2所述单克隆抗体在抗除草剂转基因植物检测中的用途。

5.权利要求2所述单克隆抗体在抗以L-phosphiothricin为活性成分的除草剂的转基因植物检测中的用途。

6.权利要求2所述单克隆抗体在转基因食品检测中的用途。

7.权利要求2所述单克隆抗体在抗以L-phosphiothricin为活性成分的除草剂的转基因食品检测中的用途。

8.权利要求2所述单克隆抗体在检测转bar/PAT基因植物中的用途。

9.权利要求2所述单克隆抗体在检测转bar/PAT基因食品中的用途。

10.一种转基因检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求2所述的单克隆抗体。

11.如权利要求10所述的检测试剂盒，所述转基因为转bar/PAT基因。

12.一种ELISA检测试剂盒，其特征在于：包含权利要求2所述的单克隆抗体。