[发明专利]脂肪酶稳定剂

说明书

技术领域

本发明涉及酶制剂领域，具体来说，本发明涉及一种脂肪酶稳定剂。

背景技术

脂肪酶是一种广泛存在于动物、植物及微生物中的酶，因为微生物具有培养简单、周期短产量大等特点，因此工业用途的酶制剂基本上都来源于微生物。

米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）脂肪酶（RML）具有较高sn-1，3选择性，广泛用于结构脂质（Structured lipids）的酶法合成，如SOS、OPO、DAG的合成。就目前工业化应用前景来看，天然的米黑根毛霉产RML的单位产量较低，且成分不稳定，提取纯化工艺复杂，生产成本高，使得其应用受到限制。因此利用基因工程技术，在合适的生产宿主菌中异源表达米黑根毛霉脂肪酶基因已经成为主流方向。诺维信公司最早报道了用米曲霉为生产宿主表达米黑根毛霉脂肪酶基因，并获得工业化生产。尽管真菌米曲霉不失为一种优良的表达载体，但其自身会分泌各种非目标蛋白，如：Novo的Lipozyme RM酶液中非目的蛋白淀粉酶的含量远高于目的蛋白RML脂肪酶，另外，还有很多其他杂蛋白如：蛋白酶等，导致其提取困难，应用受限。

毕赤酵母作为能够实现外源蛋白高效表达的优秀宿主菌近年来得到了越来越广泛的应用。RML在毕赤酵母中的表达研究也比较多，如CN101481695A利用酵母表面展示系统将改良的RML基因在毕赤酵母中表达，并将RML分泌到酵母表面，经离心，冷冻干燥获得菌体冻干粉，利用橄榄油测定RML水解活力为468.8U/g酵母干细胞。CN 102080092A利用7L发酵罐甲醇诱导毕赤酵母表达米黑根毛霉脂肪酶84h，用对硝基苯酚棕榈酸酯（pNPP）法测得发酵液的脂肪酶最高水解活力为7062.5U/ml。

毕赤酵母发酵液经提取处理后得到的RM液体脂肪酶，该液体脂肪酶在具体应用的过程中会出现保存期短，酶活降低的现象，限制了米黑根毛霉脂肪酶的进一步开发利用和研究。目前，关于提高液体酶稳定性的方法有较多的研究和报道。

郝秋娟等对淀粉液化芽孢杆菌产β-葡聚糖酶稳定剂进行了研究。在β-葡聚糖酶溶液中添加大分子亲水型多糖黄原胶、动物蛋白明胶、甘油、氯化钠可明显提高β-葡聚糖酶的热稳定性。将添加甘油120g/L、黄原胶5g/L复合稳定剂的葡聚糖酶溶液60℃处理2h，酶液的残余酶活比未经处理的酶活提高了55.3%（郝秋娟等，淀粉液化芽孢杆菌产β-葡聚糖酶培养基优化以及酶稳定剂的研究[J]，中国酿造，2006，(4)：18-22）。李品周对扩展青霉碱性脂肪酶的稳定性进行了研究，研究发现液体脂肪酶的最佳组合配方为4mM的Ca2+、0.0313M的四硼酸钠和4M的丙三醇，在40℃下可提高脂肪酶热稳定性半衰期84h，35℃下提高酶半衰期为790h（李品周，扩展青霉碱性脂肪酶稳定性研究[D]，福建师范大学硕士学位论文，2007）。薛正莲等用大分子亲水性多糖黄原胶，明显提高了糖化酶的耐热性及储存稳定性。在含有黄原胶、NaCl、甘油的缓冲体系中，糖化酶液于室温放置6个月，其酶活只损失15.2%，而对照的却损失了39.8%（薛正莲等，糖化酶稳定性的研究[J].食品与发酵工业，1999，25(4)：38-40）。陈小泉等对青霉脂肪酶的稳定剂进行了研究，青霉脂肪酶在一定浓度的钙离子存在下，显示出高的活性，当钙离子浓度为2×10-2M时，酶的相对活性达180%。乙酸钠和多羟基化合物可以作为洗涤剂的稳定剂，其中多羟基高分子化合物对青霉脂肪酶有优良的稳定和激活效果（陈小泉等，洗涤剂用碱性脂肪酶稳定剂研究[J]，南华大学学报（理工版），2001，15(2)：17-19）。