[发明专利]一种用于副溶血性弧菌分子分型的分子马达生物传感器试剂盒

权利要求书

1.一种基于分子马达生物传感器技术的副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)分子分型试剂盒，其特征在于包括以下组分：

副溶血性弧菌分子分型试剂盒组成

2.根据权利要求1所述的V.parahaemolyticus的分子马达生物传感器分子分型试剂盒，其特征在于分子马达生物传感器的构建，包括：

(1)载色体(Chromatophore)的制备：

从玫瑰红嗜热菌(Thermomicrobium roseum)中提取载色体，F₀F₁-ATPase存在于载色体上。F₀F₁-ATPase一般由8个亚基组成，分别为α₃β₃γδεab₂c_n，是一种可旋转分子马达。

(2)F-DHPE标记载色体：

F-DHPE是一种脂染料探针，可以嵌入到磷脂分子层中。同时F-DHPE也是一种pH指示剂，将其嵌入磷脂双分子层可以用来测量磷脂层外面的pH变化。在pH7.0-9.0范围内，F-DHPE的荧光强度与pH值呈正相关。本发明将F-DHPE标记到分子马达载色体磷脂分子层中用以指示F₀F₁-ATPase合成ATP的效率。

(3)生物素标记ε亚基抗体：

用生物素(biotin-AC5-Sulfo-Os)标记ε亚基抗体N端。

(4)探针合成及标记：

以V.parahaemolyticus种特异性基因tlh、tdh和毒力基因trh、toxR为模板设计探针，并用生物素(biotin-AC5-Sulfo-Os)标记探针5’端。一方面，对种特异性基因tlh和toxR的检测可以对目标菌进行鉴定；另一方面，对tdh和trh的检测可以对目标菌的致病性做出判断。探针序列如下表：

V.parahaemolyticus毒力基因及种特异性基因探针序列

(5)F₀F₁-ATPase分子马达生物传感器的构建：

首先将生物素标记的ε亚基抗体结合在F₀F₁-ATPase的ε亚基上，然后用链霉亲和素(Streptavidin)与ε亚基抗体上的生物素结合，最后将生物素标记的探针与链霉亲和素结合，高速离心去除未结合分子，即得到F₀F₁-ATPase分子马达生物传感器，4个分子马达生物传感器分别命名为Chro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR。

3.根据权利要求1所述的V.parahaemolyticus的分子马达生物传感器分子分型试剂盒，应用其进行分子分型，其特征是依次包括以下步骤：

(1)细菌的培养及DNA的提取

(2)用分子马达生物传感器进行分子分型

①取4个1.5mL EP管，各加入待测样本10μL。将EP管放入沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却；

②分别取2μLChro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR，用合成buffer稀释到一定的倍数。取稀释后的生物传感器分别加入上述EP管；

③阴性对照用10μL无菌水代替DNA提取液进行。另取1个EP管加入10μL无菌水，沸水浴中加热3min，然后立即转移到冰上至完全冷却，再加入10μL合成buffer作为本底对照，短暂振荡使反应体系混匀；

④向上述EP管中分别加入30μL启动buffer(由ADP和上述合成buffer配置，体积比1∶3)，振荡使反应体系混匀，然后立即短暂离心以除去管盖内壁上的水珠；

⑤将上述反应体系放入37℃恒温摇床中温育30min，然后将EP管从摇床中取出，分别加入450μLPBS缓冲液，振荡使体系混匀；

⑥取一块干净的96孔板，将各管中的最终反应体系加入其中，每个体系加3孔，每孔加样50μL，然后对每个加样孔分别加入30μL已配置好的荧光素酶溶液(将荧光素酶/荧光素重组缓冲液加入装有荧光素酶/荧光素的棕色玻璃瓶中，盖上瓶塞，反复颠倒几次混匀，不可振荡。使用前应将混合液在室温放置1h)，用枪反复吹打几次使体系混匀；

⑦将96孔板上机检测，读取各孔荧光值，对各组数据取平均值，然后用样本数值减去本底数值即为样本的实际荧光值；

⑧将样本荧光值绝对值与H₂O的阴性对照荧光值绝对值进行单因素方差分析，若差异显著(p＜0.05)表示检出该基因；

(3)分型判断

检出种特异性基因tlh和toxR，可判断该菌为副溶血性弧菌；检出tdh或trh，或者两者都检出，可判断该菌携带毒力基因，具有致病性。