[发明专利]一种用于副溶血性弧菌分子分型的分子马达生物传感器试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于一种对副溶血性弧菌的致病性进行快速分子分型判断的试剂盒，具体地说是用试剂盒中的F₀F₁-ATPase分子马达生物传感器Chro-tlh、Chro-tdh、Chro-trh、Chro-toxR对副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的种特异性基因tlh、toxR和毒力基因tdh、trh进行检测，从而对V.parahaemolyticus是否具有致病性做出判断。 

背景技术

V.parahaemolyticus是沿海地区常见的一种食源性致病菌，可导致患者腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。近年来，其引发的食物中毒的发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势。因此，V.parahaemolyticus的危害性不容忽视。 

尽管大多数的V.parahaemolyticus不会导致人类生病，但仍有一定特征的V.parahaemolyticus可以引起人类的疾病。已有研究表明，致病性的V.parahaemolyticus都能产生一种溶血素，即耐热性溶血毒素(Thermostable direethemolysin，TDH)或TDH相关溶血毒素(TDH related hemolysin，TRH)或两者都有，分别由tdh和trh基因编码。分子流行病学证据支持tdh、trh与肠胃炎的关系，证明tdh、trh都是V.parahaemolyticus的毒力基因。因此，对这两种基因的检测研究对于了解V.parahaemolyticus的流行趋势、预防与治疗食物中毒具有重要意义。另外，不耐热溶血素基因tlh及toxR普遍存在于临床和环境中的V.parahaemolyticus中，很多研究将其作为检测V.parahaemolyticus的种特异性基因。 

为了便于进行临床诊断、流行病学调查、食品中微生物检测及医院感染监控，微生物的分型与检测研究是必不可少的内容。目前，随着分子生物学的发展以及与流行病学的密切结合，分子分型技术以其敏感性高、特异性强、分型率和分辨率高等优点，在流行病学调查、食物中毒的预警和溯源、食源性疾病的诊断以及微生物的检测等方面发挥了重要的作用，并逐步替代了传统的生化分型和血清学分型技术，如重复序列PCR(rep-PCR)、随机扩增多态性DNA分析技术(RAPD)、限制性片段长度多态性分析(RFLP)、多位点序列分析(MLST)、脉冲场凝胶电泳(PFGE)等。然而，上述方法操作起来都比较繁琐，程序比较复杂。因此，在上述分子分型方法的优点基础上，开发一种操作简便、价格低廉的分子分型方法将具有重要意义。 

发明内容

本发明以V.parahaemolyticus毒力基因tdh、trh和种特异性基因tlh、toxR为靶基因设计4个探针，通过“ε亚基抗体-链霉素-生物素-探针”系统将探针与F₀F₁-ATPase分子马达连接构建F₀F₁-ATPase分子马达生物传感器，进而与相应辅助试剂配套构建分子马达生物传感器分子分型试剂盒，对致病性V.parahaemolyticus进行分型及检测研究，从而建立致病性V.parahaemolyticus的分子马达分子分型方法，为V.parahaemolyticus的快速分型和溯源提供技术基础。 

本发明所采用的技术方案为：以V.parahaemolyticus毒力基因tdh、trh和种特异性基因tlh、toxR为靶 基因设计4个探针，首先将生物素标记的ε亚基抗体结合在F₀F₁-ATPase的ε亚基上，然后用链霉亲和素(Streptavidin)与ε亚基抗体上的生物素结合，最后将生物素标记的探针与链霉亲和素结合，构建F₀F₁APase分子马达生物传感器，对目标V.parahaemolyticus的DNA进行检测，从而对V.parahaemolyticus的致病性做出快速判断。一方面，对种特异性基因tlh和toxR的检测可以对目标菌进行鉴定；另一方面，对tdh和trh的检测可以对目标菌的致病性做出判断。利用F₀F₁-ATPase作为载体对目标物进行检测具有快速、灵敏度高、特异性强的特点。在F₀F₁-ATPase分子马达上连接特异的核酸探针，可以实现对目标基因快速、高特异性、高通量的检测。