[发明专利]一种鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法

权利要求书

1.一种鲶鱼抗菌肽突变体，其特征在于，鲶鱼抗菌肽突变体的氨基酸序列为KGRGKQGGKVRKSS。

2.如权利要求1所述的鲶鱼抗菌肽突变体，其特征在于，所述鲶鱼抗菌肽突变体的N端形成阳离子的双亲性的α螺旋结构，C端为中性疏水性氨基酸。

3.一种鲶鱼抗菌肽突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：     

S1、将存放于冰箱中的原料试剂取出，置于干燥器中复温待用；

S2、精确称量Fmoc-AA-Resin 0.1mmol后，置于合成反应器中，用DMF冲洗六次，然后加入2～3倍Fmoc-AA-Resin体积的DMF浸泡30分钟，通入氮气使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动；

S3、加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应10分钟，然后用DMF冲洗两次；

S4、再次加入2倍Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应20分钟，然后用DMF冲洗六次；

S5、称量0.45mmol的Fmoc-AA、HOBt和HBTU，先用1ml DMF溶解HOBT及HBTU，后将溶液加入Fmoc-AA中，活化15分钟；

S6、将活化好的Fmoc-AA溶液以及1mL DIEPA同时加入Fmoc-AA-Resin中；

S7、调节氮气的流量，使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一般为2小时；

S8、反应结束后用DMF、DCM、DMF依次各洗Fmoc-AA-Resin两次；

S9、重复步骤S3至步骤S8，直到多肽序列偶联完为止；

S10、加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20%哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为10分钟和20分钟，分别用DCM、DMF、DCM依次各洗Resin 两次，最后一次洗完后，将Fmoc-AA-Resin尽量抽干，得肽树脂；

S11、配制裂解液：1g肽树脂对应10ml裂解液；

S12、将裂解液加入到合成反应器中，通入氮气反应2小时，期间需不时补充裂解液以防蒸干，另将无水乙醚置于-20℃冰箱中冷冻备用；

S13、反应完成后，将裂解液收集到预先称重的50ml离心管中，再用TFA清洗合成反应器2-3次，洗液同样收集到50ml离心管中；

S14、将冰箱中的无水乙醚取出，选择容器将乙醚倒入其中，按无水乙醚 ：裂解液＝10 ：1的体积比例将裂解液滴入冰冻的无水乙醚中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入，同时不断搅拌至不再产生沉淀为止；

S15、将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上清，然后用新鲜的冰冻无水乙醚洗涤沉淀至少三次；

S16、将所得沉淀物风干，之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥并称重，得到粗肽；

S17、NH₄HCO₃ 自然氧化法氧化粗肽：配置0.1M NH₄HCO₃（pH8.2）溶液，按多肽终浓度0.3mg/ml 的比例加入NH₄HCO₃溶液至粗肽中，室温搅拌过夜；之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥，称重备用；

S18、将氧化后的粗肽进行纯化并质谱分析鉴定，得到鲶鱼抗菌肽Parasin I突变体； 

S19、将纯化并经质谱分析鉴定合格的鲶鱼抗菌肽Parasin I突变体用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。

4.根据权利要求3所述的鲶鱼抗菌肽突变体的制备方法，其特征在于，所述步骤S18中的纯化使用Hypersil BDS C18 型反相柱进行纯化的。