[发明专利]一种鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽合成领域，特别是涉及一种鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法。 

背景技术

自从青霉素发现以来，抗生素一直是人类治疗病原微生物感染疾病的有力武器，但是随着“传统抗生素”的大量使用，致病菌的耐药性逐渐增强，“抗生素时代”正逐渐走到尽头，目前最好的抗生素也逐渐失去效果，所以寻找新的抗菌资源已成为备受关注的焦点。 

阳离子抗菌肽(cationic antibacterial peptides)一般由12~50个氨基酸残基组成的阳离子型(含过多的赖氨酸和精氨酸)的两亲性分子，其在广义上是指存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害、消除体内突变细胞的一类小分子阳离子多肽。阳离子抗菌肽是由生物细胞特定基因编码，经特定外界条件诱导产生的一类多肽。目前为止，世界上已知的抗菌肽共有1200多种，而以天然阳离子抗菌肽作模板进行人工合成的模拟肽有数千种。 

多数阳离子抗菌肽由12~50个氨基酸残基组成，相对分子质量小（4kDa左右），水溶性好，且等电点在8.9~10.7之间，具有较强的阳离子特征，具有两亲α螺旋和（或）两亲β-折叠结构。这些阳离子抗菌肽N端多富含碱性氨基酸，呈强碱性，C端均酰胺化且C端中性疏水性，它对杀菌活性至关重要。有些阳离子抗菌肽在121℃、1. 5×105Pa的高温高压下处理30min仍能保持原有活性，说明抗菌肽具有热稳定性。阳离子抗菌肽在较大的离子强度和较低或较高的pH值下仍可保持较强的活性。此外，部分阳离子抗菌肽还有抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶水解的能力。 

鲶鱼抗菌肽（ParasinⅠ）是鲶鱼受伤的上皮黏膜细胞分泌的一种抗菌肽，含有19个氨基酸残基，它是鲶鱼非特异性免疫系统的重要组成部分，分子量为2004 Da，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的最小抑制浓度（MIC）都在0.5～2mmol/L之间，且没有溶血现象。其抗菌活性是蛙皮素(magainin)的12~100倍。研究发现，鲶鱼抗菌肽（ParasinⅠ）是鱼体受到损伤时，金属蛋白酶水解鲶鱼皮肤黏液中的前体蛋白Procathepin D产生Cathepin D（组织蛋白酶D），通过它可切断未酰化的组蛋白H2A中Ser19-Arg20间的肽键，产生的19个氨基酸残基，其序列为：Lys-Gly-Arg-Gly-Lys-Gln-Gly-Gly-Lys- 

Val-Arg-Ala-Lys-Ala-Lys-Thr-Arg-Ser-Ser。

天然的阳离子抗菌肽并非完美无缺，部分对真核生物有一定的毒性，对病原物高杀灭活性的同时往往伴随着对真核生物的溶血作用。因此如何提高其活性和最大程度降低其毒性成为其分子改造的目的，也是目前抗菌肽药物开发的难点和希望所在。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种鲶鱼抗菌肽突变体及其制备方法，其具有较高抗菌活性且安全无毒。 

本发明是通过下述技术方案来解决上述技术问题的：一种鲶鱼抗菌肽突变体，其特征在于，鲶鱼抗菌肽突变体的氨基酸序列为KGRGKQGGKVRKSS。 

优选地，所述鲶鱼抗菌肽突变体的N端形成阳离子的双亲性的α螺旋结构，C端为中性疏水性氨基酸。 

本发明还提供一种鲶鱼抗菌肽突变体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：     

S1、将存放于冰箱中的原料试剂取出，置于干燥器中复温待用；

S2、精确称量Fmoc-AA-Resin 0.1mmol后，置于合成反应器中，用DMF冲洗六次，然后加入2～3倍Fmoc-AA-Resin体积的DMF浸泡30分钟，通入氮气使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动；

S3、加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应10分钟，然后用DMF冲洗两次；

S4、再次加入2倍Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应20分钟，然后用DMF冲洗六次；

S5、称量0.45mmol的Fmoc-AA、HOBt和HBTU，先用1ml DMF溶解HOBT及HBTU，后将溶液加入Fmoc-AA中，活化15分钟；

S6、将活化好的Fmoc-AA溶液以及1mL DIEPA同时加入Fmoc-AA-Resin中；

S7、调节氮气的流量，使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一般为2小时；

S8、反应结束后用DMF、DCM、DMF依次各洗Fmoc-AA-Resin两次；