[发明专利]检测BCL2L11基因多态性的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术和医学领域，尤其是分子生物学，聚合酶链式反应。

背景技术：

酪氨酸激酶抑制剂（TKI）是重要的一类抗癌靶向药物，在激酶异常的肿瘤治疗中得到了广泛应用，且效果非常好，比如断裂点簇集区-细胞abl癌基因（BCR-ABL）融合的慢性粒细胞性白血病（CML）、表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）外显子19/21突变的非小细胞肺癌（NSCLC）。但随着使用人群的不断增加，发现有部分基因突变的患者治疗效果不显著，或者有部分患者开始时效果很好，但随着治疗进行，药物的效果逐渐减弱。其中EGFR外显子20的T790M突变是导致药物耐受的重要的原因，随着研究的不断展开，发现表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor，EGFR）通路的其他突变也会导致药效，比如kirsten大鼠肉瘤病毒原癌基因（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，kras）密码子12、13、61突变、棘皮动物微管样蛋白4-间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶（EML4-ALK）融合等。当然，以上都是癌细胞特异突变，而B-细胞慢性淋巴细胞白血病/淋巴瘤-2样11（BCL2L11）基因（又名BIM)多态性也和TKI药物的耐受相关，并且其属于种系基因突变，通过非创伤性检测就可以进行，可以早期对TKI药物的适用性进行判断，更有效的治疗，节省治疗成本。

BIM基因是凋亡相关基因，参与TKI诱导的凋亡过程。当BIM的受到抑制，表达水平降低时会显著影响TKI的效果。BIM的多态性是指其基因内含子2中会缺失2903bp的DNA序列，导致BIM外显子3和4的拼接错误，得到不完整的蛋白质，使BIM不能行使功能。不完全统计，在东亚人群中这种多态性达到了12.3％，但在非洲和欧洲人群中还未发现此种变化。

目前关于BIM基因多态性的检测，相关的专利还没有，文献报道也很有限。已有的报道中所采用的检测方法是需要扩增一段4226bp的DNA序列，但是，如此长的序列在实际操作中并不容易实现，失败的几率非常高，不能开发为BIM基因多态性的稳定的检测手段。并且，当只能获得受检者的石蜡包埋组织时，其DNA由于经受过化学试剂的处理，已经断裂为500bp以下的小片段，无法采用此种方法检测。

鉴于以上的问题，一种新的、可操作性能更高的快速检测方法的发明是势在必行的。

发明内容：

本发明要解决的技术问题主要是：

BIM的多态性是指其基因内含子2中会缺失2903bp的DNA序列，导致BIM外显子3和4的拼接错误，得到不完整的蛋白质，使BIM不能行使功能。

已有的报道中所采用的检测方法是需要扩增一段4226bp的DNA序列，但是，如此长的序列在实际操作中并不容易实现，失败的几率非常高，不能开发为BIM基因多态性的稳定的检测手段。

并且，当只能获得受检者的石蜡包埋组织时，其DNA由于经受过化学试剂的处理，已经断裂为500bp以下的小片段，无法采用此种方法检测。

为了解决以上问题，本发明技术提供了一种检测BCL2L11基因多态性的方法，其包括如下实现步骤：

设计了两对引物，突变型引物以及野生型引物，一对引物跨越2903bp的缺失区域，当此片段未缺失时，实验条件限制反应，扩增不出如此长的片段的；当此片段缺失时，会扩增出一个261bp的片段；

另外一对引物在2903bp的缺失区域中，当此片段未缺失，会扩增出一个365bp的片段。

所述扩增的野生型引物序列为：

正向引物wmF：CAGAACAGACACTGGAACAAAATGA

反向引物wR：GGGAGCATTTTCATGAGTACAACAA

所述扩增的突变型引物序列为：

正向引物wmF：CAGAACAGACACTGGAACAAAATGA（与野生型F相同）

反向引物mR：GGTGGCCATACAAATCTAAGCCAG

所述具体处理步骤如下：

样本处理，取外周血2ml于EDTA抗凝管中，轻柔地颠倒混匀，4℃保存；

DNA提取，取200μL抗凝血用试剂盒提取DNA，采用电泳凝胶成像对DNA纯度和浓度作检测；

反应体系的配置，在每一个反应空中加入一定的反应体系；

按一定的程序进行扩增；

电泳检测扩增结果。