[发明专利]芋螺毒素的生物学制备方法及其产品和用途

说明书

技术领域

本发明涉及芋螺毒素的制备方法，尤其涉及一种芋螺毒素的生物学制备方法以及由该生物学方法制备得到的产品以及它们在镇痛、神经修复或戒断毒瘾中的医药用途，属于芋螺毒素的生物学制备领域。

背景技术

海洋毒素是近二十年一个新兴的研究领域，其重要进展之一是发现了一些毒性极大的小肽类毒素，其中软体动物芋螺(conus)分泌的芋螺毒素(conotoxin)是备受重视的一类神经毒素，是迄今发现的最小核酸编码的动物神经毒素肽，也是二硫键密度最高的小肽。芋螺毒素具有化学结构新颖，生物活性强，作用靶位选择性高等特点，已成为药理学和神经科学的有力工具和新药开发的新来源。依照芋螺毒素对神经肌肉系统的作用部位，将其分为四类：1、α-芋螺毒素(α-conotoxin)：其与银环蛇毒素相似，作用于神经突触后乙酰胆碱受体(AchR)起阻断作用；2、μ-芋螺毒素(μ-conotoxin)：其与河豚毒素相似，在活化相起作用，专一抑制电压敏感性钠通道；3、ω-芋螺毒素(ω-conotoxin)，专一阻断神经末梢突触前电压敏感性钙通道；4、δ-芋螺毒素(δ-conotoxin)，专一作用于电压敏感性钠通道，在非活化相起作用，延长动作电位持续时间。芋螺毒素对靶受体的作用具有高亲和性和高特异性，可以区分不同的受体亚型。虽然不同的芋螺毒素的氨基酸序列变化非常大，但它们的结构上的差异不大，尤其是表达后加工的过程基本是一致的。

αCTx(alpha conotoxin Tx)有望被直接开发成药物或作为新药的先导化合物。作用于N型VSCCs的芋螺毒素能抑制中枢神经系统的与痛觉相关的神经递质(如谷氨酸和P物质)释放，从而减轻动物的神经性疼痛，并引起了人们希望将其开发成为新的肽类止痛剂的浓厚兴趣。αCTx有望用于慢性疼痛的治疗，它相对于吗啡，具有疗效好、不成瘾的独特优点；CTx具有比吗啡药效更强和持续时间更长的镇痛效果，是通过阻断外周初级传入神经元的nAChRs而发挥止痛作用，其给药更方便(可肌注或脂肪注射)，同时也无吗啡引起的副反应(如便秘、呼吸抑制等)，极有望开发成为高效止痛药物。此外αCTx能选择性阻断nAChRs的某种亚型，除有止痛效果外，也有望开发成用于治疗焦虑症、帕金森氏病、肌肉紧张和高血压等病症的药物。alpha A conotoxin Tx1即是目前研究比较多的一种αCTx。

迄今尚未见有芋螺毒素高活性的体外表达的文献报道，可能原因有以下两点：1、在原核表达系统，无法加工去除N-端信号肽序列，无法解决C-端酰胺化问题；2、芋螺毒素分子小，碱性氨基酸较多，因此难于形成特定活性构象。由于以上原因，大部分实验室为获得具有生物活性的芋螺毒素只好转向化学合成。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种优化的芋螺毒素αACT1基因，该基因能够在昆虫宿主或细胞中高效表达具有生物学活性的芋螺毒素。

本发明的目的之二是提供一种芋螺毒素的生物学制备方法。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明将芋螺毒素αACT的原始基因序列(GenBank：AF146352.1，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所编码的氨基酸序列为SEQ IDNo.3所示)根据家蚕和多角体病毒密码子偏好性进行改造，采取了调整了GC含量及不宜峰(以延长mRNA的半衰期)、去除常用限制性内切酶位点以及原始序列中含有串联的稀有密码子(减少翻译序列甚至解除翻译装置)，破除那些影响mRNA稳定性及其与核糖体结合的茎环结构等一系列优化手段，得到优化后的芋螺毒素基因(αACT1)，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示，本发明进一步的在SEQ ID No.2所示核苷酸序列的5’端加上BamHI酶切位点和kozak序列，3’端加上EcoRI，得到SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。优化后的芋螺毒素αACT1基因能够在家蚕等昆虫宿主或细胞中高效表达具有生物学活性的芋螺毒素。

本发明进一步提供了一种芋螺毒素的生物学制备方法，该方法包括以下步骤：

(1)将芋螺毒素基因克隆到杆状病毒运载载体的表达盒中，构建得到重组转移表达载体；(2)将所构建的重组转移表达载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；(3)用重组杆状病毒感染昆虫宿主或昆虫细胞；培养被感染的昆虫宿主表达有活性的芋螺毒素；收获并纯化所表达的产物(即：芋螺毒素)，即得。