[发明专利]片段长度在500bp之内DNA的定量方法

权利要求书

1.片段长度在500bp之内DNA的定量方法，包括以下步骤：

⑴毛细管柱内壁修饰: 将毛细管内壁用0.2mol/L NaOH清洗后，分别依次将γ-甲基丙烯酰基-三（甲氧基）硅烷/甲醇溶液和质量浓度为3.4%的丙烯酰胺单体溶液充填入毛细管柱内进行共价涂层修饰；

⑵配制含TBE的筛分介质：将筛分介质聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液质量浓度为3.0%、pH值为8.2后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.45um水系微孔滤膜过滤后，即得含TBE的筛分介质；

⑶荧光染料的加入量确定：在1~15μL、浓度为1/1000的荧光染料SYBR Green Ⅰ中加入浓度为0.5ug/ml的标准品pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ) Marker 15μL混匀，再加入去离子水使总体积为30μL，最终使其荧光染料的浓度为1/30000~1/2000；在分离电压为15kv、温度为15℃的条件下采用负极-10KV电动进样10s的方式进行电泳分离，根据所述pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ) Marker电泳图中26~501bp片段大部分的峰面积为最大值时所对应的加入量确定为荧光染料加入量；

⑷标准品的线性范围考察：将标准品pUC19DNA/MspⅠ(HpaⅡ) Marker用去离子水稀释成为0.03~2.5μg/mL系列浓度稀释标准品，分别取15μL的所述稀释标准品，加入所述步骤⑶所得的荧光染料加入量，混匀后再加入去离子水至体系为30μL，然后，使用毛细管电泳仪压力系统向所述步骤⑴所得的毛细管内自动填充所述步骤⑵所得的含TBE的筛分介质，在分离电压为15kv、温度为15℃的条件下采用负极-10kv电动进样10s的方式采用毛细管电泳结合激光诱导荧光检测器进行检测；然后，根据检测结果对浓度与峰面积或峰高建立线性关系及线性范围；

⑸检测限: 根据所述步骤⑷的检测结果，计算相应信噪比S/N=3时的浓度；

⑹重现性：对3根的不同批次所述步骤⑴所得的毛细管按所述步骤⑷检测方法进行分离效果考察，计算峰面积与荧光强度的相对标准偏差；

⑺样品分析：从病变组织及正常组织的基因组DNA中选定26~501bp片段中一个基因目的片段进行扩增，然后根据所述步骤⑷进样方法进行检测即可。

2.如权利要求1所述的片段长度在500bp之内DNA的定量方法，其特征在于：所述步骤⑴中γ-甲基丙烯酰基-三（甲氧基）硅烷/甲醇溶液是指将γ-甲基丙烯酰基-三（甲氧基）硅烷与甲醇按1：1的体积比混合所得的溶液。

3.如权利要求1所述的片段长度在500bp之内DNA的定量方法，其特征在于：所述步骤⑴中丙烯酰胺单体溶液是指将3.4g丙烯酰胺溶于100mL三蒸水所得的溶液。

4.如权利要求1所述的片段长度在500bp之内DNA的定量方法，其特征在于：所述步骤⑵中1×TBE缓冲液是指在800毫升去离子水中分别加入三羟甲基氨基甲烷10.8克、硼酸5.5克、乙二胺四乙酸二钠盐0.74克，经搅拌溶解后，加去离子水将溶液定容至1L所得的缓冲液。

5.如权利要求1所述的片段长度在500bp之内DNA的定量方法，其特征在于：所述步骤⑺中的病变组织及正常组织为病理科切除并经病理诊断证明的组织。

6.如权利要求1所述的片段长度在500bp之内DNA的定量方法，其特征在于：所述步骤⑺中的扩增条件是指94℃变性30 s， 55℃退火30 s， 72℃延伸30 s，共进行30个循环。